Ruolo dell'immunità dell'ospite nella terapia di mancata risposta alla terapia con agenti antivirali diretti (DAA).

Obiettivo dello studio e ipotesi L'ipotesi alla base del progetto è che il livello di disfunzione immunitaria antivirale nell'infezione cronica da HCV sia un fattore causale che può influenzare la mancata risposta alla terapia. Tuttavia, non sono disponibili informazioni sulle caratteristiche delle singole risposte delle cellule T antivirali espresse da pazienti cronici naïve con HCV prima di iniziare la terapia con DAA in relazione al successivo esito del trattamento e al loro possibile impatto sul mancato controllo dell'infezione. I pochi risultati disponibili sulle risposte immunitarie anti-HCV nell'infezione cronica da HCV sono stati generati in pazienti trattati con regimi DAA che non sono inclusi nelle presenti linee guida senza valutazione in base all'esito. Scopo del presente studio sarà quindi quello di capire se la mancata risposta alla terapia sia associata a una più ampia e profonda disfunzione immunitaria antivirale, confrontando le risposte individuali delle cellule T HCV-specifiche in due gruppi di pazienti responder e non-responder. Il presupposto è che eventuali difetti delle risposte delle cellule T associate alla mancata risposta alla terapia con DAA non debbano essere sostanzialmente modificati da un trattamento inefficace che consenta di caratterizzare il background immunologico dei pazienti non responder dopo la fine di un ciclo di terapia inefficace e di confrontare i risultati con le risposte pretrattamento al basale di pazienti naïve e viremici che successivamente eliminano il virus. Un'analisi pre-trattamento anche per i pazienti non responder richiederebbe l'arruolamento di un numero enorme di pazienti naive per identificare un numero sufficiente di pazienti non responder, rendendo lo studio irrealizzabile ed eccessivamente lungo. Con questa strategia, il reclutamento sarà invece molto rapido perché la maggior parte dei pazienti arruolati al basale dovrebbe essere responder, mentre i pazienti non responder che saranno studiati dopo la fine della terapia e dopo un adeguato periodo di wash-out da 6 a 12 mesi e prima ritrattamento iniziale sono già stati individuati nei Centri che collaborano e saranno prontamente disponibili per lo studio non appena il protocollo sarà approvato. Sulla base dei risultati, possibile obiettivo di analisi future potrebbe essere quello di caratterizzare ulteriormente a livello molecolare i difetti funzionali delle cellule T di pazienti non-responder per definire se e con quali strategie la loro correzione possa rappresentare un approccio fattibile per indurre/ripristinare un efficiente anti -risposta virale per integrare e rafforzare l'effetto dei DAA di ultima generazione. Infine, la caratterizzazione dell'immunità protettiva nei pazienti non-responder potrebbe consentire di identificare predittori basali di non risposta alla terapia da utilizzare nella pratica clinica quotidiana.

Contesto dello studio Il tasso di risposta virale sostenuta (SVR) nei pazienti naïve non cirrotici trattati con DAA senza IFN è compreso tra il 95% e il 100%, ma il tasso di risposta è inferiore in specifici sottogruppi di pazienti, inclusi i cirrotici di genotipo 3 e i pazienti con cirrosi scompensata, indipendentemente dal genotipo infettante. L'elevata efficacia delle terapie basate su DAA è confermata nelle coorti del mondo reale, che mostrano un tasso di SVR solo leggermente inferiore rispetto agli studi di registrazione. Sebbene il tasso di fallimento della terapia con DAA sia piuttosto limitato (circa il 5%), si prevede che il numero complessivo di pazienti non responsivi sia elevato a causa dell'elevato numero di pazienti con infezione cronica da HCV che necessitano di trattamento. Il fallimento del trattamento si traduce più frequentemente in una ricaduta e meno spesso in una svolta virale durante il trattamento. Si ritiene che diversi fattori siano implicati nella mancata risposta alla terapia, tra cui l'insorgenza di mutazioni di resistenza, il trattamento subottimale dovuto a una definizione errata del genotipo e la malattia epatica avanzata.

Il ruolo dei RAV al basale nel determinare il fallimento del trattamento è ancora dibattuto e il test di resistenza al basale sembra avere un'utilità clinica limitata. Invece, l'emergenza di RAV durante i regimi basati su DAA e il suo ruolo nel determinare il fallimento virologico è ben documentato. Anche se le varianti resistenti ai farmaci vengono rilevate in un'ampia percentuale di pazienti non responsivi, il loro ruolo nel compromettere l'efficacia del trattamento non è tuttavia del tutto chiaro.

L'uso di test commerciali di seconda generazione attualmente disponibili per la genotipizzazione dell'HCV ha ridotto il rischio di errata classificazione del genotipo, ma la possibilità di infezioni miste con una percentuale di genotipi/sottotipi diversi al di sotto della sensibilità dei metodi applicati nella pratica clinica è ancora possibile causa di mancata risposta alla terapia a causa di un trattamento non ottimale.

L'emergenza di ceppi resistenti e il trattamento subottimale a causa del rilevamento errato del genotipo possono tuttavia spiegare solo una parte dei casi di fallimento del trattamento e fattori correlati all'ospite possono svolgere un ruolo, in particolare la risposta immunitaria antivirale. Infatti, è noto che le risposte immunitarie innate e adattative sono profondamente compromesse nell'infezione cronica da HCV, ma sono disponibili informazioni molto limitate sul possibile contributo che le risposte immunitarie di base possono dare all'esito finale del trattamento con DAA. Contrariamente alle terapie basate su PegIFN, studi recenti su pazienti trattati con DAA indicano che la frequenza e la funzione delle cellule CD8 specifiche per HCV possono aumentare con terapie prive di IFN con parziale inversione del loro fenotipo esaurito. Inoltre, la terapia con DAA può modulare il compartimento delle cellule NK correggendo il fenotipo attivato dalle cellule NK che è tipico dei pazienti cronici con HCV. Pertanto, il livello di compromissione al basale dell'immunità antivirale potrebbe influenzare la successiva probabilità di ripristino immunitario dopo la terapia con maggiori possibilità di resistenza al trattamento con DAA quando l'inibizione immunitaria al basale è più profonda e più ampia. Questa ipotesi richiede di essere verificata.

Endpoint primari L'obiettivo dello studio sarà quello di confrontare l'intensità (livelli totali di funzioni antivirali) e la qualità (multi-specificità e multi-funzionalità) della risposta complessiva delle cellule T HCV-specifiche in pazienti non-responder (con e senza rilevabile varianti associate alla resistenza - RAV) e responder alla terapia con DAA. Per raggiungere questo obiettivo, le risposte mediate da CD4 e CD8 saranno valutate utilizzando peptidi sintetici sovrapposti che coprono l'intero proteoma dell'HCV del genotipo 1 al fine di caratterizzare la reattività delle cellule T a tutte le proteine ​​dell'HCV, in termini di produzione di citochine (IL2, IFN- g e TNF-a) e potenziale citotossico (degranulazione CD107).

• Come endpoint primario, l'intensità complessiva delle risposte delle cellule T sarà valutata nei pazienti responder e non responder; l'intensità totale della reattività individuale delle cellule T sarà definita sommando i diversi parametri delle cellule T analizzate (produzione di citochine e citotossicità, rilevate nelle cellule CD3 totali e nei sottogruppi CD4/CD8) per ogni singolo paziente responder e non-responder; i valori risultanti verranno poi confrontati nei due gruppi di pazienti.
• Ad un secondo livello di analisi, le differenze qualitative nella reattività delle cellule T tra pazienti responder e non-responder saranno valutate in termini di multifunzionalità e multispecificità delle risposte delle cellule T HCV-specifiche, confrontando separatamente l'espressione di ogni singola funzione (IL2, IFN-g, TNF-a) e la capacità di ogni singola proteina HCV di indurre risposte delle cellule T nei due gruppi di pazienti.

Caratterizzazione delle risposte delle cellule T specifiche per HCV.

1. Per analizzare la reattività globale CD4+ e CD8+ contro le proteine ​​strutturali e non strutturali dell'HCV, verrà utilizzato un pannello completo di peptidi 15-mer sovrapposti che coprono l'intera sequenza dell'HCV (genotipi 1); Le risposte delle cellule T saranno analizzate mediante citometria a flusso intracellulare di citochine (ICS) per IFN-g, IL-2 e TNF-a e per la degranulazione (up-regolazione di CD107) in vitro (dopo 10 giorni di stimolazione del peptide) e mediante Elispot per IFN-g ex-vivo (dopo stimolazione peptidica a breve termine); epitopi peptidici sintetici con specificità HLA ristrette di classe I e classe II e noti per essere i bersagli delle risposte CD8+ e CD4+ contro diversi virus e patogeni non correlati all'HCV (CMV, EBV, FLU) saranno utilizzati come controlli.
2. Per analizzare ulteriormente la reattività delle cellule T CD8+, i destrameri HLA-A2/peptidi contenenti alcuni degli epitopi ristretti HLA-A2 più ampiamente riconosciuti di HCV saranno utilizzati nei pazienti HLA-A2+ per quantificare le cellule CD8+ specifiche del virus circolanti e per misurare la capacità di espansione mediante confrontando le frequenze delle cellule CD8+ positive al destramero ex-vivo e dopo 10 giorni di stimolazione del peptide.
3. Nei pazienti non-responder che mostrano l'emergere di mutazioni di resistenza, saranno sintetizzati peptidi specifici corrispondenti alle sequenze varianti e utilizzati per analizzare se le mutazioni emergenti possono influenzare l'attivazione e la funzione delle cellule T specifiche dell'HCV. A tal fine, verrà confrontato l'effetto stimolatorio su diverse funzioni delle cellule T di prototipi e varianti di peptidi (produzione di citochine, citotossicità, capacità di espansione)

Endpoint secondari

1. Analisi di ulteriori popolazioni immunitarie e fattori sierici noti per essere rilevanti rispetto al controllo dell'infezione virale e alla modulazione delle risposte delle cellule T.

   • Analisi delle cellule Natural Killer (NK): il fenotipo delle cellule NK sarà studiato valutando l'espressione di marcatori specifici, quali CD16, NKG2A/D, TRAIL, NKP46/NKP30, Ki67, CD38/HLA-DR mediante citometria a flusso; La funzione delle cellule NK sarà studiata testando la produzione di IFN-g/TNF-a e la degranulazione di CD107 dopo incubazione notturna di PBMC con stimoli appropriati.
   • Analisi delle cellule T regolatorie (Treg): frequenza, fenotipo e funzione saranno studiate su PBMC intere co-colorate con CD3, CD4, CD25, FoxP3 e CD45RA.
   • La concentrazione sierica di citochine, chemochine e ISG, incluse IL15, IL6, CXCL9, CXCL10, IFN-g e IL28, sarà analizzata nel siero dei pazienti mediante la tecnologia Luminex.
2. Identificazione dei predittori al basale di non risposta alla terapia con DAA Spiegazione dell'impatto che la risposta immunitaria antivirale può avere nella non risposta alle terapie con o senza inibitori della proteasi