Papel de la inmunidad del huésped en la falta de respuesta a la terapia directa con agentes antivirales (DAA)

Objetivo e hipótesis del estudio La hipótesis subyacente del proyecto es que el nivel de disfunción inmune antiviral en la infección crónica por VHC es un factor causal que puede influir en la falta de respuesta a la terapia. Sin embargo, no se dispone de información sobre las características de las respuestas de células T antivirales individuales expresadas por pacientes VHC crónicos sin tratamiento previo antes de comenzar la terapia con AAD en relación con el resultado posterior del tratamiento y su posible impacto en el fracaso del control de la infección. Los pocos resultados disponibles sobre las respuestas inmunes anti-VHC en la infección crónica por VHC se han generado en pacientes tratados con regímenes de AAD que no están incluidos en la presente guía sin evaluación según el resultado. El objetivo del presente estudio será comprender si la falta de respuesta a la terapia se asocia con una disfunción inmune antiviral más amplia y profunda, comparando las respuestas individuales de células T específicas del VHC en dos grupos de pacientes respondedores y no respondedores. La suposición que se hace es que los posibles defectos de las respuestas de las células T asociados con la falta de respuesta a la terapia con DAA no deben modificarse sustancialmente por un tratamiento ineficaz que permita caracterizar los antecedentes inmunológicos de los pacientes que no responden después del final de un ciclo de terapia ineficaz y para compare los resultados con las respuestas iniciales previas al tratamiento de pacientes virémicos ingenuos que posteriormente eliminan el virus. Un análisis previo al tratamiento también para pacientes que no responden requeriría inscribir una gran cantidad de pacientes ingenuos para identificar una cantidad suficiente de pacientes que no responden, lo que hace que el estudio sea inviable y extremadamente largo. Con esta estrategia, el reclutamiento será muy rápido porque se espera que la mayoría de los pacientes reclutados al inicio del estudio sean respondedores, mientras que los pacientes que no respondan serán estudiados después del final de la terapia y después de un período de lavado adecuado de 6 a 12 meses y antes. ya han sido identificados en los Centros colaboradores y estarán disponibles para el estudio tan pronto como se apruebe el protocolo. Con base en los resultados, el posible objetivo de futuros análisis podría ser caracterizar aún más a nivel molecular los defectos funcionales de las células T de los pacientes que no responden para definir si su corrección puede representar un enfoque factible para inducir/restaurar un sistema antirretroviral eficaz y mediante qué estrategias. -respuesta viral para complementar y potenciar el efecto de los AAD de última generación. Finalmente, la caracterización de la inmunidad protectora en pacientes no respondedores podría permitir identificar predictores basales de falta de respuesta a la terapia para ser utilizados en la práctica clínica diaria.

Antecedentes del estudio La tasa de respuesta viral sostenida (RVS) en pacientes naïve no cirróticos tratados con AAD libres de IFN es de entre el 95 % y el 100 %, pero la tasa de respuesta es menor en subgrupos específicos de pacientes, incluidos los cirróticos de genotipo 3 y los pacientes con cirrosis descompensada, independientemente del genotipo infectante. La alta eficacia de las terapias basadas en AAD se confirma en cohortes del mundo real, que muestran una tasa de RVS solo ligeramente inferior a los estudios de registro. Aunque la tasa de fracaso de la terapia con AAD es bastante limitada (alrededor del 5 %), se espera que el número total de pacientes que no responden sea alto debido al elevado número de pacientes con infección crónica por VHC que necesitan tratamiento. El fracaso del tratamiento con mayor frecuencia da como resultado una recaída y, con menos frecuencia, un avance viral durante el tratamiento. Se cree que diferentes factores están implicados en la falta de respuesta a la terapia, incluida la aparición de mutaciones de resistencia, el tratamiento subóptimo debido a una definición incorrecta del genotipo y la enfermedad hepática avanzada.

Aún se debate el papel de las RAV iniciales para determinar el fracaso del tratamiento y las pruebas de resistencia iniciales parecen tener una utilidad clínica limitada. En cambio, la aparición de RAV durante los regímenes basados ​​en AAD y su papel en la determinación del fracaso virológico está bien documentada. Incluso si se detectan variantes resistentes a los medicamentos en una gran proporción de pacientes que no responden, su papel en el deterioro de la eficacia del tratamiento, sin embargo, no está totalmente claro.

El uso de ensayos comerciales de segunda generación actualmente disponibles para el genotipado del VHC ha reducido el riesgo de clasificación errónea de genotipos, pero la posibilidad de infecciones mixtas con un porcentaje de diferentes genotipos/subtipos por debajo de la sensibilidad de los métodos aplicados en la práctica clínica sigue siendo posible. causa de la falta de respuesta a la terapia debido a un tratamiento subóptimo.

Sin embargo, la aparición de cepas resistentes y el tratamiento subóptimo debido a la detección incorrecta del genotipo pueden explicar solo una parte de los casos de fracaso del tratamiento y los factores relacionados con el huésped pueden desempeñar un papel, en particular, la respuesta inmune antiviral. De hecho, se sabe que las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas están profundamente alteradas en la infección crónica por VHC, pero se dispone de información muy limitada sobre la posible contribución que las respuestas inmunitarias de fondo pueden aportar al resultado final del tratamiento con AAD. A diferencia de las terapias basadas en PegIFN, estudios recientes en pacientes tratados con DAA indican que la frecuencia y la función de las células CD8 específicas del VHC pueden aumentar con terapias sin IFN con una reversión parcial de su fenotipo agotado. Además, la terapia con DAA puede modular el compartimento de células NK corrigiendo el fenotipo activado por células NK que es típico de los pacientes crónicos con VHC. Por lo tanto, el nivel de deterioro inicial de la inmunidad antiviral podría influir en la probabilidad posterior de restauración inmunológica tras la terapia con más posibilidades de resistencia al tratamiento con DAA cuando la inhibición inmune inicial es más profunda y amplia. Esta hipótesis requiere ser probada.

Criterios de valoración primarios El objetivo del estudio será comparar la intensidad (niveles totales de funciones antivirales) y la calidad (multiespecificidad y multifuncionalidad) de la respuesta global de células T específicas del VHC en pacientes que no responden (con y sin detección variantes asociadas a la resistencia - RAV) y respondedores a la terapia con AAD. Para lograr este objetivo, las respuestas mediadas por CD4 y CD8 se evaluarán mediante el uso de péptidos sintéticos superpuestos que cubren el proteoma general del VHC del genotipo 1 para caracterizar la reactividad de las células T a todas las proteínas del VHC, en términos de producción de citoquinas (IL2, IFN- g y TNF-a) y potencial citotóxico (desgranulación de CD107).

• Como criterio de valoración principal, la intensidad general de las respuestas de las células T se evaluará en pacientes que respondan y que no respondan; la intensidad total de la reactividad de las células T individuales se definirá sumando los diferentes parámetros de las células T analizados (producción de citocinas y citotoxicidad, detectadas en el total de células CD3 y subconjuntos de CD4/CD8) para cada paciente respondedor y no respondedor individual; los valores resultantes se compararán luego en los dos grupos de pacientes.
• En un segundo nivel de análisis, las diferencias cualitativas en la reactividad de las células T entre los pacientes que responden y los que no responden se evaluarán en términos de multifuncionalidad y multiespecificidad de las respuestas de las células T específicas del VHC, comparando la expresión de cada función individual por separado. (IL2, IFN-g, TNF-a) y la capacidad de cada proteína individual del VHC para inducir respuestas de células T en los dos grupos de pacientes.

Caracterización de las respuestas de células T específicas del VHC.

1. Para analizar la reactividad global de CD4+ y CD8+ frente a proteínas VHC estructurales y no estructurales, se utilizará un panel completo de péptidos superpuestos de 15 unidades que cubren la secuencia completa del VHC (genotipos 1); Las respuestas de las células T se analizarán mediante tinción de citoquinas intracelulares (ICS) por citometría de flujo para IFN-g, IL-2 y TNF-a y para la desgranulación (regulación positiva de CD107) in vitro (después de 10 días de estimulación con péptido) y por Elispot para IFN-g ex-vivo (después de una estimulación peptídica a corto plazo); Se utilizarán como controles epítopos de péptidos sintéticos con especificidades restringidas de clase I y clase II de HLA y que se sabe que son los objetivos de las respuestas CD8+ y CD4+ contra diferentes virus y patógenos no relacionados con el VHC (CMV, EBV, FLU).
2. Para analizar más a fondo la reactividad de los linfocitos T CD8+, se utilizarán dextrámeros peptídicos/HLA-A2 que contienen algunos de los epítopos del VHC restringidos por HLA-A2 más reconocidos en pacientes con HLA-A2+ para cuantificar los linfocitos CD8+ circulantes específicos del virus y medir la capacidad de expansión mediante comparando las frecuencias de células CD8+ positivas para dextrámeros ex vivo y después de 10 días de estimulación con péptidos.
3. En los pacientes que no responden y muestran la aparición de mutaciones de resistencia, se sintetizarán péptidos específicos correspondientes a las secuencias variantes y se utilizarán para analizar si las mutaciones emergentes pueden influir en la activación y función de las células T específicas del VHC. Para ello, se comparará el efecto estimulante sobre las diferentes funciones de las células T de los péptidos prototipo y variante (producción de citocinas, citotoxicidad, capacidad de expansión).

Criterios de valoración secundarios

1. Análisis de poblaciones inmunes adicionales y factores séricos que se sabe que son relevantes con respecto al control de la infección por virus y la modulación de las respuestas de las células T.

   • Análisis de células asesinas naturales (NK): el fenotipo de las células NK se estudiará mediante la evaluación de la expresión de marcadores específicos, como CD16, NKG2A/D, TRAIL, NKP46/NKP30, Ki67, CD38/HLA-DR mediante citometría de flujo; La función de las células NK se estudiará analizando la producción de IFN-g/TNF-a y la desgranulación de CD107 tras la incubación de PBMC durante la noche con los estímulos apropiados.
   • Análisis de células T reguladoras (Treg): la frecuencia, el fenotipo y la función se estudiarán en PBMC completas coteñidas con CD3, CD4, CD25, FoxP3 y CD45RA.
   • La tecnología Luminex analizará la concentración sérica de citoquinas, quimioquinas e ISG, incluidas IL15, IL6, CXCL9, CXCL10, IFN-g e IL28, en los sueros de los pacientes.
2. Identificación de predictores basales de falta de respuesta a la terapia con AAD Elucidación del impacto que la respuesta inmune antiviral puede tener en la falta de respuesta a terapias con o sin inhibidores de la proteasa