宿主免疫在对直接抗病毒剂 (DAA) 治疗无反应中的作用

研究目标和假设 该项目的基本假设是，慢性 HCV 感染中的抗病毒免疫功能障碍水平是影响对治疗无反应的致病因素。 然而，关于初始慢性 HCV 患者在开始 DAA 治疗之前表达的个体抗病毒 T 细胞反应的特征与随后的治疗结果及其对控制感染失败的可能影响的信息尚不可用。 慢性 HCV 感染中抗 HCV 免疫反应的少数可用结果是在接受 DAA 方案治疗的患者中产生的，这些方案未包括在本指南中，没有根据结果进行评估。 因此，本研究的目的是通过比较两组有反应和无反应患者的个体 HCV 特异性 T 细胞反应，了解对治疗无反应是否与更广泛和更深入的抗病毒免疫功能障碍有关。 所做的假设是，与对 DAA 治疗无反应相关的 T 细胞反应的可能缺陷不应被无效治疗实质性改变，从而允许在无效治疗周期结束后表征无反应患者的免疫学背景，并将结果与随后清除病毒的天真、病毒血症患者的基线预处理反应进行比较。 同样针对无反应患者的治疗前分析将需要招募大量未接受治疗的患者，以便确定足够数量的无反应患者，这使得研究不可行且时间过长。 通过这种策略，招募将非常迅速，因为大多数在基线登记的患者预计会有反应，而无反应患者将在治疗结束后和 6 至 12 个月的充分清除期后以及之前进行研究合作中心已经确定了开始再治疗的时间，并且一旦方案获得批准，就可以随时用于研究。 基于这些结果，未来分析的可能目标可能是在分子水平上进一步表征无反应患者的 T 细胞功能缺陷，以确定它们的纠正是否以及通过哪些策略可以代表诱导/恢复有效抗-病毒反应以补充和加强上一代 DAA 的作用。 最后，对无反应患者的保护性免疫特性进行表征，可以确定在日常临床实践中使用的治疗无反应的基线预测因子。

研究背景 接受无干扰素 DAA 治疗的初治非肝硬化患者的持续病毒反应 (SVR) 率为 95% 至 100%，但特定亚组患者的反应率较低，包括基因 3 型肝硬化患者和失代偿性肝硬化，与感染基因型无关。 基于 DAA 的疗法的高效性在现实世界队列中得到证实，显示 SVR 率仅略低于注册研究。 尽管 DAA 治疗的失败率非常有限（约 5%），但由于需要治疗的慢性 HCV 感染患者人数众多，预计无反应患者的总数会很高。 治疗失败最常导致复发，较少导致治疗中的病毒突破。 不同的因素被认为与治疗无反应有关，包括耐药突变的出现、由于不正确的基因型定义和晚期肝病导致的次优治疗。

基线 RAV 在确定治疗失败中的作用仍在争论中，基线耐药性测试的临床效用似乎有限。 相反，在基于 DAA 的方案中出现 RAV 及其在确定病毒学失败中的作用已得到充分记录。 即使在大部分无反应患者中检测到耐药变异，它们在削弱治疗效果方面的作用仍不完全清楚。

使用目前可用的第二代 HCV 基因分型商业化验降低了基因型错误分类的风险，但不同基因型/亚型混合感染的可能性仍然低于临床实践中应用的方法的敏感性由于次优治疗导致对治疗无反应的原因。

然而，由于不正确的基因型检测导致耐药菌株的出现和次优治疗只能解释部分治疗失败病例，宿主相关因素可能发挥作用，特别是抗病毒免疫反应。 事实上，已知先天性和适应性免疫反应在慢性 HCV 感染中严重受损，但关于背景免疫反应可能对 DAA 治疗的最终结果可能产生的贡献的信息非常有限。 与基于 PegIFN 的疗法相反，最近对 DAA 治疗患者的研究表明，在无 IFN 疗法下，HCV 特异性 CD8 细胞的频率和功能会增加，并部分逆转其衰竭表型。 此外，DAA 疗法可以调节 NK 细胞区室，纠正慢性 HCV 患者典型的 NK 细胞活化表型。 因此，当基线免疫抑制更深和更广时，抗病毒免疫的基线损伤水平可能会影响随后治疗后免疫恢复的可能性，并且有更多机会抵抗 DAA 治疗。 这个假设需要检验。

主要终点研究的目的是比较无反应者（有和没有可检测抗性相关变体 - RAVs）和对 DAA 治疗的反应者。 为了实现这一目标，将通过使用覆盖基因型 1 的整个 HCV 蛋白质组的重叠合成肽来评估 CD4 和 CD8 介导的反应，以便在细胞因子产生（IL2、IFN- g 和 TNF-a) 和细胞毒性潜力（CD107 脱颗粒）。

• 作为主要终点，将在有反应和无反应的患者中评估 T 细胞反应的总体强度；个体 T 细胞反应性的总强度将通过对每个个体反应者和非反应者患者的不同分析 T 细胞参数（细胞因子产生和细胞毒性，如在总 CD3 细胞和 CD4 / CD8 亚群中检测到的）求和来定义；然后将在两组患者中比较结果值。
• 在第二级分析中，将通过分别比较每个单独功能的表达，根据 HCV 特异性 T 细胞反应的多功能性和多特异性来评估反应者和非反应者之间 T 细胞反应性的定性差异（IL2、IFN-g、TNF-a）以及每种单独的 HCV 蛋白在两组患者中诱导 T 细胞反应的能力。

HCV特异性T细胞反应的表征。

1. 为了分析针对结构和非结构 HCV 蛋白的全局 CD4+ 和 CD8+ 反应性，将使用覆盖整个 HCV（基因型 1）序列的重叠 15 聚体肽的综合面板； T 细胞反应将通过流式细胞术细胞内细胞因子染色 (ICS) 分析 IFN-g、IL-2 和 TNF-a 以及体外脱颗粒（CD107 的上调）（肽刺激 10 天后）和通过Elispot 用于 IFN-g 离体（短期肽刺激后）；具有 HLA I 类和 II 类限制特异性且已知是针对不同 HCV 无关病毒和病原体（CMV、EBV、FLU）的 CD8+ 和 CD4+ 反应靶标的合成肽表位将用作对照。
2. 为了进一步分析 CD8+ T 细胞反应性，HLA-A2/肽葡聚体包含一些最广泛认可的 HLA-A2 限制性 HCV 表位，将用于 HLA-A2+ 患者，以量化循环病毒特异性 CD8+ 细胞并通过以下方法测量扩增能力比较离体和肽刺激 10 天后的葡聚糖阳性 CD8+ 细胞频率。
3. 在出现耐药突变的无反应患者中，将合成与变异序列相对应的特定肽，并用于分析新出现的突变是否会影响 HCV 特异性 T 细胞的活化和功能。 为此，将比较原型肽和变体肽对不同 T 细胞功能的刺激作用（细胞因子产生、细胞毒性、扩增能力）

次要终点

1. 分析已知与控制病毒感染和调节 T 细胞反应相关的其他免疫群体和血清因子。

   • 自然杀伤 (NK) 细胞分析：通过流式细胞术评估特定标记物（如 CD16、NKG2A/D、TRAIL、NKP46/NKP30、Ki67、CD38/HLA-DR）的表达来研究 NK 细胞表型； NK 细胞的功能将通过测试 IFN-g/TNF-a 的产生和 CD107 脱颗粒在 PBMC 过夜孵育适当的刺激下进行研究。
   • T 调节细胞 (Treg) 的分析：频率、表型和功能将在与 CD3、CD4、CD25、FoxP3 和 CD45RA 共染色的整个 PBMC 上进行研究。
   • 将通过 Luminex 技术分析患者血清中细胞因子、趋化因子和 ISG 的血清浓度，包括 IL15、IL6、CXCL9、CXCL10、IFN-g 和 IL28。
2. 确定对 DAA 治疗无反应的基线预测因子 阐明抗病毒免疫反应对使用或不使用蛋白酶抑制剂的治疗无反应的影响