Роль иммунитета хозяина в отсутствии ответа на терапию прямыми противовирусными агентами (DAA)

Цель исследования и гипотеза Основная гипотеза проекта заключается в том, что уровень противовирусной иммунной дисфункции при хронической инфекции ВГС является причинным фактором, который может влиять на отсутствие ответа на терапию. Однако информация об особенностях индивидуального противовирусного Т-клеточного ответа, выраженного у пациентов с хроническим ВГС, ранее не получавших лечения, до начала терапии ПППД в связи с последующим исходом лечения и их возможным влиянием на неспособность контролировать инфекцию, отсутствует. Немногочисленные доступные результаты по иммунному ответу против HCV при хронической инфекции HCV были получены у пациентов, получавших ПППД по схемам, не включенным в настоящее руководство, без оценки исходов. Таким образом, цель настоящего исследования будет заключаться в том, чтобы понять, связано ли отсутствие ответа на терапию с более широкой и глубокой противовирусной иммунной дисфункцией, путем сравнения индивидуальных ответов Т-клеток, специфичных для ВГС, в двух группах пациентов с ответом и без ответа. Сделано предположение, что возможные дефекты Т-клеточного ответа, связанные с отсутствием ответа на терапию ПППД, не должны быть существенно модифицированы неэффективным лечением, позволяющим охарактеризовать иммунологический фон неответивших пациентов после окончания неэффективного цикла терапии и сравните результаты с исходными ответами до лечения наивных пациентов с виремией, которые впоследствии избавились от вируса. Предварительный анализ также для пациентов, не ответивших на лечение, потребовал бы включения огромного числа наивных пациентов, чтобы выявить достаточное количество пациентов, не ответивших на лечение, что сделало бы исследование невыполнимым и чрезвычайно долгим. При использовании этой стратегии набор будет происходить очень быстро, поскольку ожидается, что большинство пациентов, включенных в исследование на исходном уровне, будут отвечать на лечение, в то время как пациенты, не ответившие на лечение, которые будут изучаться после окончания терапии и после адекватного периода вымывания от 6 до 12 месяцев и ранее. начала повторного лечения уже определены в сотрудничающих центрах и будут легко доступны для исследования, как только протокол будет одобрен. Основываясь на результатах, возможная цель будущих анализов может состоять в дальнейшей характеристике на молекулярном уровне функциональных дефектов Т-клеток у пациентов, не ответивших на лечение, чтобы определить, может ли и с помощью каких стратегий их коррекция представлять собой осуществимый подход к индукции/восстановлению эффективной антиретровирусной терапии. -вирусный ответ для дополнения и усиления эффекта ПППД последнего поколения. Наконец, характеристика защитного иммунитета у пациентов, не ответивших на лечение, может позволить определить исходные предикторы отсутствия ответа на терапию для использования в повседневной клинической практике.

Предыстория исследования Частота устойчивого вирусного ответа (УВО) у пациентов без цирроза печени, ранее не получавших лечение ПППД без IFN, составляет от 95% до 100%, но частота ответа ниже в определенных подгруппах пациентов, включая пациентов с генотипом 3 и пациентов с циррозом печени. декомпенсированный цирроз, независимо от генотипа инфекции. Высокая эффективность терапии на основе ПППД подтверждена в реальных когортах, в которых уровень УВО лишь немного ниже, чем в регистрационных исследованиях. Хотя частота неэффективности терапии ПППД весьма ограничена (около 5%), ожидается, что общее число пациентов, не ответивших на лечение, будет высоким из-за большого числа пациентов с хронической инфекцией ВГС, нуждающихся в лечении. Неудача лечения чаще всего приводит к рецидиву и реже к прорыву вируса во время лечения. Считается, что к отсутствию ответа на терапию причастны различные факторы, в том числе появление мутаций резистентности, неоптимальное лечение из-за неправильного определения генотипа и запущенное заболевание печени.

Роль исходных RAV в определении неэффективности лечения все еще обсуждается, и тестирование исходной резистентности, по-видимому, имеет ограниченную клиническую ценность. Наоборот, хорошо задокументировано появление RAV во время схем, основанных на DAA, и его роль в определении вирусологической неудачи. Даже если лекарственно-устойчивые варианты выявляются у значительной части пациентов, не ответивших на лечение, их роль в ухудшении эффективности лечения, тем не менее, не совсем ясна.

Использование доступных в настоящее время коммерческих тестов второго поколения для генотипирования ВГС снизило риск ошибочной классификации генотипа, но возможность смешанных инфекций с процентным соотношением различных генотипов/подтипов ниже чувствительности методов, применяемых в клинической практике, все еще возможна. причиной отсутствия ответа на терапию из-за неоптимального лечения.

Однако появление резистентных штаммов и неоптимальное лечение из-за неправильного определения генотипа могут объяснить только часть случаев неэффективности лечения, и определенную роль могут играть факторы, связанные с хозяином, в частности противовирусный иммунный ответ. Действительно, известно, что врожденные и адаптивные иммунные реакции сильно нарушены при хронической инфекции ВГС, но имеется очень ограниченная информация о возможном вкладе фоновых иммунных реакций в окончательный результат лечения ПППД. В отличие от терапии, основанной на пег-ИФН, недавние исследования у пациентов, получавших ПППД, показали, что частота и функция HCV-специфических клеток CD8 могут увеличиваться при терапии без ИФН с частичным реверсированием их истощенного фенотипа. Более того, терапия ПППД может модулировать компартмент NK-клеток, корректируя фенотип активированных NK-клеток, который типичен для пациентов с хроническим ВГС. Таким образом, уровень исходного нарушения противовирусного иммунитета может влиять на последующую вероятность восстановления иммунитета после терапии с большей вероятностью резистентности к лечению ПППД, когда исходное подавление иммунитета глубже и шире. Эта гипотеза требует проверки.

Первичные конечные точки Целью исследования будет сравнение интенсивности (общие уровни противовирусных функций) и качества (полиспецифичность и многофункциональность) общего ВГС-специфического Т-клеточного ответа у пациентов, не ответивших на лечение (с обнаруживаемым или неопределяемым варианты, ассоциированные с резистентностью - RAV) и отвечающие на терапию ПППД. Для достижения этой цели будут оцениваться CD4- и CD8-опосредованные ответы с использованием перекрывающихся синтетических пептидов, покрывающих общий протеом ВГС генотипа 1, чтобы охарактеризовать реактивность Т-клеток ко всем белкам ВГС с точки зрения продукции цитокинов (ИЛ-2, ИФН- g и TNF-a) и цитотоксический потенциал (дегрануляция CD107).

• В качестве первичной конечной точки будет оцениваться общая интенсивность Т-клеточного ответа у пациентов с ответом и без ответа; общая интенсивность индивидуальной реактивности Т-клеток будет определяться путем суммирования различных проанализированных параметров Т-клеток (продукция цитокинов и цитотоксичность, обнаруженная в общем числе клеток CD3 и субпопуляциях CD4/CD8) для каждого отдельного пациента с ответом и без ответа; полученные значения будут затем сравниваться в двух группах пациентов.
• На втором уровне анализа качественные различия в реактивности Т-клеток между ответившими и не ответившими пациентами будут оцениваться с точки зрения многофункциональности и мультиспецифичности ВГС-специфических Т-клеточных ответов путем сравнения экспрессии каждой отдельной функции в отдельности. (IL2, IFN-g, TNF-a) и способность каждого отдельного белка HCV индуцировать Т-клеточный ответ в двух группах пациентов.

Характеристика HCV-специфических Т-клеточных ответов.

1. Для анализа глобальной реактивности CD4+ и CD8+ в отношении структурных и неструктурных белков ВГС будет использоваться всеобъемлющая панель перекрывающихся 15-мерных пептидов, охватывающая всю последовательность ВГС (генотипы 1); Ответы Т-клеток будут анализировать с помощью проточной цитометрии внутриклеточного цитокинового окрашивания (ICS) на IFN-γ, IL-2 и TNF-α и на дегрануляцию (активация CD107) in vitro (после 10 дней пептидной стимуляции) и с помощью Elispot для IFN-g ex-vivo (после кратковременной пептидной стимуляции); синтетические пептидные эпитопы с ограниченной специфичностью HLA класса I и класса II и известные как мишени ответов CD8+ и CD4+ против различных вирусов и патогенов, не связанных с HCV (CMV, EBV, FLU), будут использоваться в качестве контролей.
2. Для дальнейшего анализа реактивности CD8+ Т-клеток HLA-A2/пептидные декстрамеры, содержащие некоторые из наиболее широко известных HLA-A2-рестриктированных эпитопов ВГС, будут использоваться у пациентов с HLA-A2+ для количественного определения циркулирующих вирус-специфических клеток CD8+ и для измерения способности к размножению с помощью сравнение частоты декстрамер-положительных клеток CD8+ ex-vivo и после 10 дней пептидной стимуляции.
3. У пациентов, не ответивших на лечение, у которых проявляются мутации резистентности, будут синтезированы специфические пептиды, соответствующие вариантным последовательностям, и они будут использованы для анализа того, могут ли возникающие мутации влиять на активацию и функцию Т-клеток, специфичных для ВГС. С этой целью будет проведено сравнение стимулирующего действия прототипа и варианта пептидов на различные функции Т-клеток (продукция цитокинов, цитотоксичность, способность к экспансии).

Дополнительные конечные точки

1. Анализ дополнительных иммунных популяций и факторов сыворотки, которые, как известно, имеют отношение к контролю вирусной инфекции и модулированию ответов Т-клеток.

   • Анализ естественных клеток-киллеров (NK): фенотип NK-клеток будет изучаться путем оценки экспрессии специфических маркеров, таких как CD16, NKG2A/D, TRAIL, NKP46/NKP30, Ki67, CD38/HLA-DR, с помощью проточной цитометрии; Функцию NK-клеток будут изучать путем тестирования продукции IFN-g/TNF-α и дегрануляции CD107 при инкубации PBMC в течение ночи с соответствующими стимулами.
   • Анализ регуляторных Т-клеток (Treg): частота, фенотип и функция будут изучаться на целых РВМС, окрашенных совместно с CD3, CD4, CD25, FoxP3 и CD45RA.
   • Сывороточная концентрация цитокинов, хемокинов и ISG, включая IL15, IL6, CXCL9, CXCL10, IFN-g и IL28, будет проанализирована в сыворотке пациентов с помощью технологии Luminex.
2. Выявление исходных предикторов отсутствия ответа на терапию ПППД Выяснение влияния противовирусного иммунного ответа на отсутствие ответа на терапию с ингибиторами протеазы или без них