Vertsimmunitetens rolle i ikke-respons på direkte antiviral terapi (DAA)

Studiemål og hypotese Den underliggende hypotesen til prosjektet er at nivået av antiviral immundysfunksjon ved kronisk HCV-infeksjon er en årsaksfaktor som kan påvirke manglende respons på terapi. Informasjon om egenskapene til individuelle antivirale T-celleresponser uttrykt av naive kroniske HCV-pasienter før start av DAA-behandling i forhold til det påfølgende resultatet av behandlingen og deres mulige innvirkning på manglende kontroll av infeksjon er imidlertid ikke tilgjengelig. De få tilgjengelige resultatene på anti-HCV-immunresponser ved kronisk HCV-infeksjon har blitt generert hos pasienter behandlet med DAA-regimer som ikke er inkludert i disse retningslinjene uten evaluering i henhold til resultatet. Målet med denne studien vil således være å forstå om manglende respons på terapi er assosiert med en bredere og dypere antiviral immundysfunksjon, ved å sammenligne individuelle HCV-spesifikke T-celleresponser i to grupper av responderende og ikke-responderende pasienter. Antakelsen som er gjort er at mulige defekter av T-celleresponser assosiert med manglende respons på DAA-terapi ikke bør modifiseres vesentlig av en ineffektiv behandling som gjør det mulig å karakterisere den immunologiske bakgrunnen til pasienter som ikke responderer etter slutten av en ineffektiv terapisyklus og sammenligne resultater med baseline-forbehandlingsresponser fra naive, viremiske pasienter som deretter fjerner viruset. En forhåndsbehandlingsanalyse også for ikke-responderende pasienter vil kreve å registrere et stort antall naive pasienter for å identifisere et tilstrekkelig antall ikke-responderende pasienter, noe som gjør studien ugjennomførbar og ekstremt lang. Ved denne strategien vil rekrutteringen i stedet foregå veldig raskt fordi de fleste pasienter som ble innrullert ved baseline forventes å svare, mens pasienter som ikke responderer som vil bli studert etter avsluttet behandling og etter en tilstrekkelig utvaskingsperiode på 6 til 12 måneder og før starter re-behandling er allerede identifisert i de samarbeidende sentrene og vil være lett tilgjengelig for studien så snart protokollen er godkjent. Basert på resultatene, kan mulige mål for fremtidige analyser være å karakterisere ytterligere på et molekylært nivå T-celle funksjonelle defekter hos ikke-responderende pasienter for å definere om og med hvilke strategier deres korreksjon kan representere en gjennomførbar tilnærming for å indusere/gjenopprette en effektiv anti -viral respons for å komplementere og styrke effekten av siste generasjons DAA. Til slutt kan karakterisering av beskyttende immunitet hos ikke-responderende pasienter tillate å identifisere baseline-prediktorer for manglende respons på terapi som skal brukes i den daglige kliniske praksisen.

Studiebakgrunn Frekvensen av vedvarende viral respons (SVR) hos naive ikke-cirrhotiske pasienter behandlet med IFN-fri DAA er mellom 95 % og 100 %, men responsraten er lavere i spesifikke undergrupper av pasienter, inkludert genotype 3 cirrhotics og pasienter med dekompensert cirrhose, uavhengig av den smittende genotypen. Den høye effekten av DAA-baserte terapier er bekreftet i kohorter i den virkelige verden, som viser en SVR-rate bare litt lavere enn registreringsstudier. Selv om frekvensen av svikt i DAA-behandling er ganske begrenset (rundt 5 %), forventes det totale antallet ikke-responderende pasienter å være høyt på grunn av det høye antallet kronisk HCV-infiserte pasienter som trenger behandling. Behandlingssvikt resulterer oftest i tilbakefall og sjeldnere i viralt gjennombrudd under behandling. Ulike faktorer antas å være involvert i manglende respons på terapi, inkludert fremvekst av resistensmutasjoner, suboptimal behandling på grunn av feil genotypedefinisjon og avansert leversykdom.

Rollen til baseline RAV-er for å fastslå behandlingssvikt er fortsatt omdiskutert, og baseline-resistenstesting ser ut til å ha begrenset klinisk nytte. I stedet er fremveksten av RAV-er under DAA-baserte regimer og dens rolle i å bestemme virologisk svikt godt dokumentert. Selv om medikamentresistente varianter påvises hos en stor andel av ikke-responderende pasienter, er deres rolle i å svekke behandlingseffekten imidlertid ikke helt klar.

Bruk av for tiden tilgjengelige andregenerasjons kommersielle analyser for HCV-genotyping har redusert risikoen for feilklassifisering av genotype, men muligheten for blandede infeksjoner med en prosentandel av ulike genotyper/subtyper under sensitiviteten til metodene som brukes i klinisk praksis er fortsatt en mulig årsak til manglende respons på terapi på grunn av suboptimal behandling.

Fremveksten av resistente stammer og suboptimal behandling på grunn av feil genotypedeteksjon kan imidlertid bare forklare en del av tilfeller av behandlingssvikt, og vertsrelaterte faktorer kan spille en rolle, spesielt den antivirale immunresponsen. Faktisk er medfødte og adaptive immunresponser kjent for å være dypt svekket ved kronisk HCV-infeksjon, men svært begrenset informasjon er tilgjengelig om det mulige bidraget som bakgrunnsimmunresponser kan gi til det endelige resultatet av DAA-behandling. I motsetning til PegIFN-baserte terapier, indikerer nyere studier i DAA-behandlede pasienter at frekvensen og funksjonen til HCV-spesifikke CD8-celler kan øke under IFN-frie terapier med delvis reversering av deres utmattede fenotype. Dessuten kan DAA-terapi modulere NK-cellerommet og korrigere den NK-celleaktiverte fenotypen som er typisk for kroniske HCV-pasienter. Dermed kan nivået av svekkelse av antiviral immunitet ved baseline påvirke den påfølgende sannsynligheten for immungjenoppretting ved terapi med større sjanser for resistens mot DAA-behandling når immunhemmingen i utgangspunktet er dypere og bredere. Denne hypotesen må testes.

Primære endepunkter Målet med studien vil være å sammenligne intensitet (totale nivåer av antivirale funksjoner) og kvalitet (multispesifisitet og multifunksjonalitet) av den generelle HCV-spesifikke T-celleresponsen hos pasienter som ikke reagerer (med og uten påvisbar) resistensassosierte varianter - RAV) og responder på DAA-terapi. For å oppnå dette målet vil CD4- og CD8-medierte responser bli vurdert ved å bruke overlappende syntetiske peptider som dekker det totale HCV-proteomet til genotype 1 for å karakterisere T-celle-reaktivitet til alle HCV-proteiner, når det gjelder cytokinproduksjon (IL2, IFN- g og TNF-a) og cytotoksisk potensial (CD107 degranulering).

• Som et primært endepunkt vil den totale intensiteten av T-celleresponser bli vurdert hos responder- og non-responderende pasienter; den totale intensiteten av individuell T-celle-reaktivitet vil bli definert ved å summere de forskjellige analyserte T-celleparametrene (cytokinproduksjon og cytotoksisitet, som påvist i totale CD3-celler og CD4/CD8-undergrupper) for hver enkelt responder og non-responder pasient; de resulterende verdiene vil deretter bli sammenlignet i de to gruppene av pasienter.
• På et andre analysenivå vil kvalitative forskjeller i T-celle-reaktivitet mellom responderende og ikke-responderende pasienter bli vurdert når det gjelder multifunksjonalitet og multispesifisitet av HCV-spesifikke T-celleresponser, ved å sammenligne uttrykket av hver enkelt funksjon separat. (IL2, IFN-g, TNF-a) og kapasiteten til hvert enkelt HCV-protein til å indusere T-celleresponser i de to gruppene av pasienter.

Karakterisering av HCV-spesifikke T-celleresponser.

1. For å analysere global CD4+ og CD8+ reaktivitet mot strukturelle og ikke-strukturelle HCV proteiner, vil et omfattende panel av overlappende 15-mer peptider som dekker hele HCV (genotype 1) sekvensen bli brukt; T-celleresponser vil bli analysert ved flow-cytometrisk intracellulær cytokinfarging (ICS) for IFN-g, IL-2 og TNF-a og for degranulering (oppregulering av CD107) in vitro (etter 10 dager med peptidstimulering) og ved Elispot for IFN-g ex-vivo (etter kortvarig peptidstimulering); syntetiske peptidepitoper med HLA klasse I- og klasse II-begrensede spesifisiteter og kjent for å være målene for CD8+ og CD4+ responser mot forskjellige HCV-urelaterte virus og patogener (CMV, EBV, FLU) vil bli brukt som kontroller.
2. For ytterligere å analysere CD8+ T-cellereaktivitet, vil HLA-A2/peptid-dekstramerer som inneholder noen av de mest anerkjente HLA-A2-begrensede epitopene av HCV bli brukt i HLA-A2+-pasienter for å kvantifisere sirkulerende virusspesifikke CD8+-celler og for å måle ekspansjonskapasitet ved å sammenligne dextramer-positive CD8+ cellefrekvenser ex-vivo og etter 10 dager med peptidstimulering.
3. Hos ikke-responderende pasienter som viser fremveksten av resistensmutasjoner, vil spesifikke peptider som tilsvarer variantsekvensene syntetiseres og brukes til å analysere om nye mutasjoner kan påvirke HCV-spesifikk T-celleaktivering og funksjon. For dette formålet vil den stimulerende effekten på ulike T-cellefunksjoner til prototype- og variantpeptider (cytokinproduksjon, cytotoksisitet, ekspansjonskapasitet) sammenlignes

Sekundære endepunkter

1. Analyse av ytterligere immunpopulasjoner og serumfaktorer kjent for å være relevante med hensyn til kontroll av virusinfeksjon og modulering av T-celleresponser.

   • Natural Killer (NK) celleanalyse: NK celle fenotype vil bli studert ved å vurdere ekspresjonen av spesifikke markører, slik som CD16, NKG2A/D, TRAIL, NKP46/NKP30, Ki67, CD38/HLA-DR ved flowcytometri; NK-cellefunksjon vil bli studert ved å teste IFN-g/TNF-a-produksjon og CD107-degranulering etter PBMC-inkubering over natten med passende stimuli.
   • Analyse av T-regulatoriske celler (Treg): frekvens, fenotype og funksjon vil bli studert på hele PBMC-er co-farget med CD3, CD4, CD25, FoxP3 og CD45RA.
   • Serumkonsentrasjon av cytokiner, kjemokiner og ISG, inkludert IL15, IL6, CXCL9, CXCL10, IFN-g og IL28, vil bli analysert i pasientenes sera med Luminex-teknologien.
2. Identifisering av baseline prediktorer for manglende respons på DAA-terapi Belysning av virkningen som den antivirale immunresponsen kan ha ved manglende respons på terapier med eller uten proteasehemmere