Role hostitelské imunity při nereagování na přímou terapii antivirovým agentem (DAA)

Cíl studie a hypotéza Základní hypotézou projektu je, že míra antivirové imunitní dysfunkce u chronické HCV infekce je kauzálním faktorem, který může ovlivnit nereagování na léčbu. Informace o vlastnostech individuálních antivirových T buněčných odpovědí vyjádřených naivními chronickými HCV pacienty před zahájením terapie DAA ve vztahu k následnému výsledku léčby a jejich možnému vlivu na selhání kontroly infekce však nejsou k dispozici. Několik dostupných výsledků o imunitních odpovědích proti HCV u chronické infekce HCV bylo získáno u pacientů léčených režimy DAA, které nejsou zahrnuty v současných pokynech, bez hodnocení podle výsledku. Cílem této studie bude tedy porozumět tomu, zda je nereagování na terapii spojeno s širší a hlubší antivirovou imunitní dysfunkcí, a to srovnáním individuálních HCV-specifických T-buněčných odpovědí u dvou skupin pacientů, kteří reagují a nereagují. Vychází se z předpokladu, že možné defekty odpovědí T lymfocytů spojené se selháním odpovědi na terapii DAA by neměly být podstatně modifikovány neúčinnou léčbou umožňující charakterizovat imunologické pozadí nereagujících pacientů po ukončení neúčinného cyklu terapie a porovnejte výsledky s výchozími reakcemi před léčbou u naivních, viremických pacientů, kteří následně virus odstranili. Analýza před léčbou také u pacientů, kteří nereagují na léčbu, by vyžadovala zařazení velkého počtu dosud neléčených pacientů, aby bylo možné identifikovat dostatečný počet pacientů, kteří nereagují, což činí studii neproveditelnou a mimořádně dlouhou. Touto strategií bude nábor místo toho velmi rychlý, protože se očekává, že většina pacientů zařazených na začátku bude reagovat, zatímco pacienti nereagující na léčbu, kteří budou studováni po ukončení léčby a po přiměřeném vymývacím období 6 až 12 měsíců a před zahajovací přeléčení již bylo identifikováno ve spolupracujících centrech a bude snadno dostupné pro studii, jakmile bude schválen protokol. Na základě výsledků by možným cílem budoucích analýz mohlo být dále na molekulární úrovni charakterizovat funkční defekty T buněk u pacientů, kteří nereagovali, a definovat, zda a jakými strategiemi může jejich korekce představovat proveditelný přístup k vyvolání/obnovení účinného anti -virová odpověď pro doplnění a posílení účinku poslední generace DAA. Konečně, charakterizace protektivní imunity u nereagujících pacientů by mohla umožnit identifikovat základní prediktory nereagování na terapii, které by se měly používat v každodenní klinické praxi.

Pozadí studie Míra setrvalé virové odpovědi (SVR) u naivních necirhotických pacientů léčených DAA bez IFN je mezi 95 % a 100 %, ale míra odpovědi je nižší u specifických podskupin pacientů, včetně cirhotiků genotypu 3 a pacientů s dekompenzovaná cirhóza, bez ohledu na infekční genotyp. Vysoká účinnost terapií na bázi DAA je potvrzena v reálných kohortách, které vykazují míru SVR jen mírně nižší než registrační studie. Ačkoli je míra selhání terapie DAA dosti omezená (kolem 5 %), očekává se, že celkový počet nereagujících pacientů bude vysoký kvůli vysokému počtu chronicky infikovaných pacientů s HCV, kteří potřebují léčbu. Selhání léčby vede nejčastěji k relapsu a méně často k průlomu viru během léčby. Předpokládá se, že na nereagování na terapii se podílejí různé faktory, včetně vzniku rezistentních mutací, suboptimální léčby v důsledku nesprávné definice genotypu a pokročilého onemocnění jater.

Role výchozích hodnot RAV při určování selhání léčby je stále diskutována a zdá se, že základní testování rezistence má omezenou klinickou využitelnost. Místo toho je dobře zdokumentován vznik RAV během režimů založených na DAA a jeho role při určování virologického selhání. I když jsou varianty rezistentní vůči lékům detekovány u velké části pacientů, kteří nereagují na léčbu, není jejich úloha při snižování účinnosti léčby zcela jasná.

Použití v současnosti dostupných komerčních testů druhé generace pro HCV genotypizaci snížilo riziko chybné klasifikace genotypu, ale stále je možná možnost smíšených infekcí s procentem různých genotypů/subtypů pod citlivostí metod používaných v klinické praxi. příčina neodpovědi na terapii v důsledku suboptimální léčby.

Vznik rezistentních kmenů a suboptimální léčba v důsledku nesprávné detekce genotypu však může vysvětlit pouze část případů selhání léčby a roli mohou hrát faktory související s hostitelem, zejména antivirová imunitní odpověď. Je skutečně známo, že vrozené a adaptivní imunitní reakce jsou hluboce narušeny u chronické infekce HCV, ale jsou k dispozici velmi omezené informace o možném příspěvku, který mohou imunitní reakce na pozadí poskytnout ke konečnému výsledku léčby DAA. Na rozdíl od terapií založených na PegIFN nedávné studie u pacientů léčených DAA naznačují, že frekvence a funkce HCV-specifických CD8 buněk se může zvýšit při terapiích bez IFN s částečným zvratem jejich vyčerpaného fenotypu. Kromě toho může terapie DAA modulovat kompartment NK buněk a korigovat fenotyp aktivovaný NK buňkami, který je typický pro pacienty s chronickou HCV. Úroveň základního poškození antivirové imunity by tedy mohla ovlivnit následnou pravděpodobnost obnovení imunity po terapii s větší pravděpodobností rezistence na léčbu DAA, když je základní imunitní inhibice hlubší a širší. Tuto hypotézu je třeba otestovat.

Primární koncové body Cílem studie bude porovnat intenzitu (celkové úrovně antivirových funkcí) a kvalitu (multispecifičnost a multifunkčnost) celkové HCV-specifické T buněčné odpovědi u pacientů, kteří nereagují (s a bez detekovatelné varianty spojené s rezistencí - RAVs) a respondér na terapii DAA. K dosažení tohoto cíle budou hodnoceny odpovědi zprostředkované CD4 a CD8 pomocí překrývajících se syntetických peptidů pokrývajících celkový proteom HCV genotypu 1, aby se charakterizovala reaktivita T buněk na všechny proteiny HCV, pokud jde o produkci cytokinů (IL2, IFN- g a TNF-a) a cytotoxický potenciál (degranulace CD107).

• Jako primární cílový bod bude hodnocena celková intenzita odpovědí T buněk u pacientů, kteří reagují a nereagují; celková intenzita individuální reaktivity T lymfocytů bude definována součtem různých analyzovaných parametrů T lymfocytů (produkce cytokinů a cytotoxicita, jak jsou detekovány v celkových CD3 buňkách a podskupinách CD4/CD8) pro každého jednotlivého reagujícího a nereagujícího pacienta; výsledné hodnoty budou následně porovnány ve dvou skupinách pacientů.
• Na druhé úrovni analýzy budou posouzeny kvalitativní rozdíly v reaktivitě T buněk mezi pacienty, kteří reagují a nereagují, z hlediska multifunkčnosti a multispecifičnosti HCV-specifických odpovědí T buněk, a to porovnáním exprese každé jednotlivé funkce zvlášť. (IL2, IFN-g, TNF-a) a schopnost každého jednotlivého HCV proteinu indukovat odpovědi T buněk u dvou skupin pacientů.

Charakterizace HCV-specifických T-buněčných odpovědí.

1. K analýze globální CD4+ a CD8+ reaktivity proti strukturním a nestrukturálním HCV proteinům bude použit komplexní panel překrývajících se 15-merních peptidů pokrývajících celou HCV (genotypy 1) sekvenci; Reakce T buněk budou analyzovány průtokovým cytometrickým intracelulárním cytokinovým barvením (ICS) na IFN-g, IL-2 a TNF-a a na degranulaci (up-regulace CD107) in vitro (po 10 dnech stimulace peptidem) a pomocí Elispot pro IFN-g ex-vivo (po krátkodobé stimulaci peptidem); jako kontroly budou použity syntetické peptidové epitopy s HLA třídou I- a třídou II-omezenými specificitami a známými jako cíle CD8+ a CD4+ odpovědí proti různým HCV nepříbuzným virům a patogenům (CMV, EBV, FLU).
2. K další analýze reaktivity CD8+ T buněk budou použity HLA-A2/peptidové dextramery obsahující některé z nejrozšířenějších HLA-A2 omezených epitopů HCV u HLA-A2+ pacientů ke kvantifikaci cirkulujících virově specifických CD8+ buněk a k měření expanzní kapacity pomocí porovnáním dextramer-pozitivních CD8+ buněčných frekvencí ex-vivo a po 10 dnech stimulace peptidem.
3. U nereagujících pacientů vykazujících vznik mutací rezistence budou syntetizovány specifické peptidy odpovídající variantním sekvencím a použity k analýze, zda vznikající mutace mohou ovlivnit HCV-specifickou aktivaci a funkci T buněk. Za tímto účelem bude porovnán stimulační účinek na různé funkce T buněk prototypových a variantních peptidů (produkce cytokinů, cytotoxicita, kapacita expanze).

Sekundární koncové body

1. Analýza dalších imunitních populací a sérových faktorů, o kterých je známo, že jsou relevantní s ohledem na kontrolu virové infekce a modulaci odpovědí T buněk.

   • Analýza přirozených zabíječů (NK): Fenotyp NK buněk bude studován hodnocením exprese specifických markerů, jako jsou CD16, NKG2A/D, TRAIL, NKP46/NKP30, Ki67, CD38/HLA-DR pomocí průtokové cytometrie; Funkce NK buněk bude studována testováním produkce IFN-g/TNF-a a degranulace CD107 po inkubaci PBMC přes noc s vhodnými stimuly.
   • Analýza T regulačních buněk (Treg): frekvence, fenotyp a funkce budou studovány na celých PBMC společně obarvených CD3, CD4, CD25, FoxP3 a CD45RA.
   • Sérové ​​koncentrace cytokinů, chemokinů a ISG, včetně IL15, IL6, CXCL9, CXCL10, IFN-g a IL28, budou analyzovány v séru pacientů technologií Luminex.
2. Identifikace základních prediktorů nereagování na terapii DAA Objasnění dopadu, který může mít antivirová imunitní reakce při nereagování na terapie s inhibitory proteázy nebo bez nich