Rola odporności gospodarza w braku odpowiedzi na terapię bezpośrednim środkiem przeciwwirusowym (DAA)

Cel badania i hipoteza Hipoteza leżąca u podstaw projektu jest taka, że ​​poziom dysfunkcji odporności przeciwwirusowej w przewlekłym zakażeniu HCV jest czynnikiem sprawczym, który może wpływać na brak odpowiedzi na terapię. Brak jest jednak informacji na temat cech poszczególnych odpowiedzi przeciwwirusowych limfocytów T wyrażanych przez nieleczonych pacjentów z przewlekłym HCV przed rozpoczęciem terapii DAA w odniesieniu do późniejszego wyniku leczenia i ich możliwego wpływu na niepowodzenie kontroli zakażenia. Nieliczne dostępne wyniki dotyczące odpowiedzi immunologicznej anty-HCV w przewlekłym zakażeniu HCV uzyskano u pacjentów leczonych schematami DAA, które nie zostały uwzględnione w niniejszych wytycznych bez oceny w zależności od wyniku. Celem niniejszego badania będzie zatem zrozumienie, czy brak odpowiedzi na terapię jest związany z szerszą i głębszą dysfunkcją odporności przeciwwirusowej, poprzez porównanie odpowiedzi poszczególnych komórek T specyficznych dla HCV w dwóch grupach pacjentów odpowiadających i niereagujących. Przyjęto założenie, że ewentualne defekty odpowiedzi limfocytów T związane z brakiem odpowiedzi na terapię DAA nie powinny być istotnie modyfikowane przez nieskuteczne leczenie, co pozwoli na scharakteryzowanie tła immunologicznego pacjentów niereagujących po zakończeniu nieskutecznego cyklu terapii i porównać wyniki z wyjściowymi odpowiedziami przed leczeniem u naiwnych pacjentów z wiremią, którzy następnie usunęli wirusa. Analiza przed leczeniem, również dla pacjentów niereagujących na leczenie, wymagałaby włączenia ogromnej liczby pacjentów nieleczonych wcześniej w celu zidentyfikowania wystarczającej liczby pacjentów niereagujących na leczenie, co czyni badanie niewykonalnym i niezwykle długim. Dzięki tej strategii rekrutacja będzie zamiast tego bardzo szybka, ponieważ oczekuje się, że większość pacjentów włączonych na początku badania będzie odpowiadać, podczas gdy pacjenci niereagujący, którzy będą badani po zakończeniu terapii i po odpowiednim okresie wypłukiwania trwającym od 6 do 12 miesięcy i przed osoby rozpoczynające ponowne leczenie zostały już zidentyfikowane we współpracujących ośrodkach i będą łatwo dostępne do badania, gdy tylko protokół zostanie zatwierdzony. W oparciu o wyniki możliwym celem przyszłych analiz mogłoby być dalsze scharakteryzowanie na poziomie molekularnym defektów funkcjonalnych limfocytów T u pacjentów niereagujących na leczenie w celu określenia, czy i za pomocą jakich strategii ich korekta może stanowić wykonalne podejście do indukowania/przywracania skutecznego działania przeciwnowotworowego -odpowiedź wirusowa w celu uzupełnienia i wzmocnienia działania DAA ostatniej generacji. Wreszcie, scharakteryzowanie odporności ochronnej u pacjentów niereagujących na leczenie może pozwolić na zidentyfikowanie wyjściowych predyktorów braku odpowiedzi na terapię do zastosowania w codziennej praktyce klinicznej.

Tło badania Odsetek trwałej odpowiedzi wirusologicznej (SVR) u dotychczas nieleczonych pacjentów bez marskości wątroby leczonych DAA bez IFN wynosi od 95% do 100%, ale odsetek odpowiedzi jest niższy w określonych podgrupach pacjentów, w tym z marskością genotypu 3 i pacjentami z marskością niewyrównaną marskością wątroby, niezależnie od genotypu infekującego. Wysoka skuteczność terapii opartych na DAA została potwierdzona w rzeczywistych kohortach, które wykazują odsetek SVR tylko nieznacznie niższy niż w badaniach rejestracyjnych. Chociaż odsetek niepowodzeń terapii DAA jest dość ograniczony (około 5%), oczekuje się, że ogólna liczba pacjentów niereagujących na leczenie będzie wysoka ze względu na dużą liczbę pacjentów przewlekle zakażonych HCV, którzy wymagają leczenia. Niepowodzenie leczenia najczęściej skutkuje nawrotem, a rzadziej przełomem wirusowym w trakcie leczenia. Uważa się, że za brak odpowiedzi na terapię odpowiedzialne są różne czynniki, w tym pojawienie się mutacji opornych, nieoptymalne leczenie z powodu nieprawidłowej definicji genotypu i zaawansowana choroba wątroby.

Rola wyjściowych RAV w określaniu niepowodzenia leczenia jest nadal przedmiotem dyskusji, a wyjściowe testy oporności wydają się mieć ograniczoną użyteczność kliniczną. Zamiast tego dobrze udokumentowane jest pojawienie się RAV podczas schematów opartych na DAA i ich rola w określaniu niepowodzenia wirusologicznego. Nawet jeśli warianty lekooporne zostaną wykryte u dużej części pacjentów niereagujących na leczenie, ich rola w osłabianiu skuteczności leczenia nie jest jednak całkowicie jasna.

Zastosowanie obecnie dostępnych komercyjnych testów drugiej generacji do genotypowania HCV zmniejszyło ryzyko błędnej klasyfikacji genotypów, ale nadal możliwa jest możliwość występowania zakażeń mieszanych z odsetkiem różnych genotypów/podtypów poniżej czułości metod stosowanych w praktyce klinicznej przyczyną braku odpowiedzi na terapię z powodu suboptymalnego leczenia.

Pojawienie się opornych szczepów i nieoptymalne leczenie z powodu nieprawidłowego wykrywania genotypu może jednak wyjaśnić tylko część przypadków niepowodzeń leczenia, a rolę mogą odgrywać czynniki związane z gospodarzem, w szczególności przeciwwirusowa odpowiedź immunologiczna. Rzeczywiście wiadomo, że wrodzone i adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne są głęboko upośledzone w przewlekłym zakażeniu HCV, ale dostępne są bardzo ograniczone informacje na temat możliwego wkładu, jaki podstawowe odpowiedzi immunologiczne mogą wnieść w ostateczny wynik leczenia DAA. W przeciwieństwie do terapii opartych na PegIFN, ostatnie badania na pacjentach leczonych DAA wskazują, że częstość i funkcja komórek CD8 specyficznych dla HCV może wzrosnąć w przypadku terapii bez IFN z częściowym odwróceniem ich wyczerpanego fenotypu. Ponadto terapia DAA może modulować przedział komórek NK, korygując fenotyp aktywowany przez komórki NK, który jest typowy dla pacjentów z przewlekłym HCV. Zatem poziom wyjściowego upośledzenia odporności przeciwwirusowej może wpływać na późniejsze prawdopodobieństwo przywrócenia odporności po terapii z większymi szansami na oporność na leczenie DAA, gdy wyjściowe hamowanie immunologiczne jest głębsze i szersze. Hipoteza ta wymaga sprawdzenia.

Pierwszorzędowe punkty końcowe Celem badania będzie porównanie intensywności (całkowitego poziomu funkcji przeciwwirusowych) i jakości (wieloswoistości i wielofunkcyjności) ogólnej odpowiedzi limfocytów T specyficznej dla HCV u pacjentów warianty związane z opornością – RAV) i osoby reagujące na terapię DAA. Aby osiągnąć ten cel, odpowiedzi zależne od CD4 i CD8 zostaną ocenione przy użyciu nakładających się syntetycznych peptydów pokrywających cały proteom HCV genotypu 1 w celu scharakteryzowania reaktywności komórek T wobec wszystkich białek HCV pod względem produkcji cytokin (IL2, IFN- gi TNF-a) i potencjał cytotoksyczny (degranulacja CD107).

• Pierwszorzędowym punktem końcowym będzie ocena ogólnej intensywności odpowiedzi limfocytów T u pacjentów z odpowiedzią i bez odpowiedzi; całkowita intensywność indywidualnej reaktywności komórek T zostanie określona przez zsumowanie różnych analizowanych parametrów komórek T (wytwarzanie cytokin i cytotoksyczność, jak wykryto w całkowitej liczbie komórek CD3 i podzbiorach CD4/CD8) dla każdego indywidualnego pacjenta reagującego i niereagującego; otrzymane wartości zostaną następnie porównane w dwóch grupach pacjentów.
• Na drugim poziomie analizy jakościowe różnice w reaktywności limfocytów T między pacjentami reagującymi i niereagującymi zostaną ocenione pod względem wielofunkcyjności i wieloswoistości odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla HCV, poprzez porównanie ekspresji każdej indywidualnej funkcji z osobna (IL2, IFN-g, TNF-a) i zdolność każdego pojedynczego białka HCV do indukowania odpowiedzi komórek T w dwóch grupach pacjentów.

Charakterystyka odpowiedzi komórek T specyficznych dla HCV.

1. Aby przeanalizować globalną reaktywność CD4+ i CD8+ wobec strukturalnych i niestrukturalnych białek HCV, wykorzystany zostanie kompleksowy panel nakładających się 15-merowych peptydów obejmujących całą sekwencję HCV (genotypy 1); Odpowiedzi limfocytów T będą analizowane za pomocą cytometrii przepływowej barwienia wewnątrzkomórkowych cytokin (ICS) pod kątem IFN-γ, IL-2 i TNF-α oraz pod kątem degranulacji (regulacja w górę CD107) in vitro (po 10 dniach stymulacji peptydem) oraz przez Elispot dla IFN-g ex vivo (po krótkotrwałej stymulacji peptydem); syntetyczne epitopy peptydowe o specyficzności ograniczonej do HLA klasy I i klasy II, o których wiadomo, że są celami odpowiedzi CD8+ i CD4+ przeciwko różnym wirusom i patogenom niepowiązanym z HCV (CMV, EBV, FLU) zostaną użyte jako kontrole.
2. W celu dalszej analizy reaktywności limfocytów T CD8+, u pacjentów z HLA-A2+ zostaną użyte dekstramery HLA-A2/peptydowe zawierające niektóre z najbardziej rozpoznawalnych epitopów HCV ograniczonych do HLA-A2 w celu ilościowego określenia krążących komórek CD8+ swoistych dla wirusa i zmierzenia zdolności ekspansji poprzez porównanie częstotliwości komórek CD8+ dodatnich w dekstramerze ex vivo i po 10 dniach stymulacji peptydem.
3. U pacjentów niereagujących na leczenie, wykazujących pojawienie się mutacji oporności, zostaną zsyntetyzowane specyficzne peptydy odpowiadające sekwencjom wariantów i wykorzystane do analizy, czy pojawiające się mutacje mogą wpływać na aktywację i funkcję limfocytów T specyficznych dla HCV. W tym celu porównany zostanie stymulujący wpływ peptydów prototypowych i wariantowych na różne funkcje limfocytów T (wytwarzanie cytokin, cytotoksyczność, zdolność ekspansji)

drugorzędowe punkty końcowe

1. Analiza dodatkowych populacji immunologicznych i czynników surowicy, o których wiadomo, że są istotne w odniesieniu do kontroli infekcji wirusowej i modulacji odpowiedzi komórek T.

   • Analiza komórek naturalnych zabójców (NK): fenotyp komórek NK będzie badany poprzez ocenę ekspresji specyficznych markerów, takich jak CD16, NKG2A/D, TRAIL, NKP46/NKP30, Ki67, CD38/HLA-DR za pomocą cytometrii przepływowej; Czynność komórek NK będzie badana przez testowanie wytwarzania IFN-g/TNF-a i degranulacji CD107 po całonocnej inkubacji PBMC z odpowiednimi bodźcami.
   • Analiza komórek regulatorowych T (Treg): częstotliwość, fenotyp i funkcja będą badane na całych PBMC współbarwionych CD3, CD4, CD25, FoxP3 i CD45RA.
   • Stężenie cytokin, chemokin i ISG w surowicy, w tym IL15, IL6, CXCL9, CXCL10, IFN-g i IL28, będzie analizowane w surowicach pacjentów za pomocą technologii Luminex.
2. Identyfikacja wyjściowych predyktorów braku odpowiedzi na terapię DAA Wyjaśnienie wpływu, jaki przeciwwirusowa odpowiedź immunologiczna może mieć na brak odpowiedzi na terapie z inhibitorami proteazy lub bez nich