Værtsimmunitetens rolle i ikke-respons på direkte antiviral agent (DAA) terapi

Undersøgelsens formål og hypotese Den underliggende hypotese for projektet er, at niveauet af anti-viral immun dysfunktion ved kronisk HCV-infektion er en årsagsfaktor, som kan påvirke manglende respons på terapi. Oplysninger om træk ved individuelle anti-virale T-celle-responser udtrykt af naive kroniske HCV-patienter før påbegyndelse af DAA-behandling i relation til det efterfølgende behandlingsresultat og deres mulige indvirkning på den manglende kontrol med infektion er imidlertid ikke tilgængelig. De få tilgængelige resultater om anti-HCV-immunresponser ved kronisk HCV-infektion er blevet genereret hos patienter behandlet med DAA-regimer, som ikke er inkluderet i nærværende retningslinjer uden evaluering i henhold til resultatet. Formålet med nærværende undersøgelse vil således være at forstå, om ikke-respons på terapi er forbundet med en bredere og dybere anti-viral immun dysfunktion, ved at sammenligne individuelle HCV-specifikke T-celle-responser i to grupper af responder- og non-responder-patienter. Antagelsen er, at mulige defekter af T-celle-responser forbundet med manglende respons på DAA-terapi ikke bør modificeres væsentligt af en ineffektiv behandling, der gør det muligt at karakterisere den immunologiske baggrund for non-responderende patienter efter afslutningen af ​​en ineffektiv behandlingscyklus og til sammenligne resultater med baseline forbehandlingsresponser fra naive, viremiske patienter, som efterfølgende renser virussen. En forbehandlingsanalyse, også for non-responderende patienter, ville kræve at indskrive et stort antal naive patienter for at identificere et tilstrækkeligt antal non-responderende patienter, hvilket gør undersøgelsen umulig og overordentlig lang. Ved denne strategi vil rekrutteringen i stedet være meget hurtig, fordi de fleste patienter, der er indskrevet ved baseline, forventes at være responderende, mens non-responderende patienter, som vil blive undersøgt efter endt behandling og efter en passende udvaskningsperiode på 6 til 12 måneder og før begyndende genbehandling er allerede blevet identificeret i de samarbejdende centre og vil være let tilgængelige for undersøgelsen, så snart protokollen er godkendt. Baseret på resultaterne kunne det mulige formål med fremtidige analyser være at karakterisere yderligere på et molekylært niveau de T-cellefunktionelle defekter hos non-responderpatienter for at definere, om og med hvilke strategier deres korrektion kan repræsentere en gennemførlig tilgang til at inducere/genoprette en effektiv anti -viral respons til at komplementere og styrke effekten af ​​sidste generations DAA. Endelig kunne karakterisering af beskyttende immunitet hos ikke-responderende patienter gøre det muligt at identificere baseline-prædiktorer for manglende respons på terapi, der skal bruges i den daglige kliniske praksis.

Undersøgelsesbaggrund Hyppigheden af ​​vedvarende viral respons (SVR) hos naive ikke-cirrhotiske patienter behandlet med IFN-fri DAA er mellem 95 % og 100 %, men responsraten er lavere i specifikke undergrupper af patienter, inklusive genotype 3 cirrhotika og patienter med dekompenseret cirrhose, uanset den inficerende genotype. Den høje effektivitet af DAA-baserede terapier er bekræftet i kohorter fra den virkelige verden, som viser en SVR-rate kun lidt lavere end registreringsundersøgelser. Selvom antallet af svigtende DAA-behandling er ret begrænset (ca. 5%), forventes det samlede antal ikke-responderende patienter at være højt på grund af det høje antal kronisk HCV-inficerede patienter, som har behov for behandling. Behandlingssvigt resulterer oftest i tilbagefald og sjældnere i viralt gennembrud under behandlingen. Forskellige faktorer menes at være impliceret i manglende respons på terapi, herunder fremkomsten af ​​resistensmutationer, suboptimal behandling på grund af forkert genotypedefinition og fremskreden leversygdom.

Rollen af ​​baseline-RAV'er i at bestemme behandlingssvigt er stadig omdiskuteret, og baseline-resistenstestning ser ud til at have begrænset klinisk nytte. I stedet er fremkomsten af ​​RAV'er under DAA-baserede regimer og dets rolle i at bestemme virologisk svigt veldokumenteret. Selv hvis lægemiddelresistente varianter påvises hos en stor del af ikke-responderende patienter, er deres rolle i at forringe behandlingens effektivitet dog ikke helt klar.

Brugen af ​​aktuelt tilgængelige andengenerations kommercielle assays til HCV-genotypning har reduceret risikoen for genotypefejlklassificering, men muligheden for blandede infektioner med en procentdel af forskellige genotyper/undertyper under sensitiviteten af ​​de metoder, der anvendes i den kliniske praksis, er stadig en evt. årsag til manglende respons på terapi på grund af suboptimal behandling.

Fremkomst af resistente stammer og suboptimal behandling på grund af ukorrekt genotypedetektion kan dog kun forklare en del af tilfælde af behandlingssvigt, og værtsrelaterede faktorer kan spille en rolle, især det antivirale immunrespons. Faktisk er medfødte og adaptive immunresponser kendt for at være dybt svækket ved kronisk HCV-infektion, men meget begrænset information er tilgængelig om det mulige bidrag, som baggrundsimmunresponser kan give til det endelige resultat af DAA-behandling. I modsætning til PegIFN-baserede terapier indikerer nyere undersøgelser i DAA-behandlede patienter, at hyppigheden og funktionen af ​​HCV-specifikke CD8-celler kan stige under IFN-fri terapier med delvis reversering af deres udmattede fænotype. Desuden kan DAA-terapi modulere NK-cellerummet og korrigere den NK-celleaktiverede fænotype, som er typisk for kroniske HCV-patienter. Niveauet af baseline svækkelse af anti-viral immunitet kan således påvirke den efterfølgende sandsynlighed for immungenopretning efter terapi med flere chancer for resistens over for DAA-behandling, når baseline immunhæmning er dybere og bredere. Denne hypotese skal testes.

Primære endepunkter Formålet med undersøgelsen vil være at sammenligne intensitet (totale niveauer af antivirale funktioner) og kvalitet (multispecificitet og multifunktionalitet) af det overordnede HCV-specifikke T-cellerespons hos patienter, der ikke reagerer (med og uden påviselig resistensassocierede varianter - RAV'er) og responder på DAA-terapi. For at nå dette mål vil CD4- og CD8-medierede responser blive vurderet ved at bruge overlappende syntetiske peptider, der dækker det overordnede HCV-proteom af genotype 1 for at karakterisere T-celle-reaktivitet over for alle HCV-proteiner i form af cytokinproduktion (IL2, IFN- g og TNF-a) og cytotoksisk potentiale (CD107-degranulering).

• Som et primært endepunkt vil den overordnede intensitet af T-celleresponser blive vurderet hos responderende og non-responderende patienter; den totale intensitet af individuelle T-cellereaktivitet vil blive defineret ved at summere de forskellige analyserede T-celleparametre (cytokinproduktion og cytotoksicitet, som påvist i samlede CD3-celler og CD4/CD8-undergrupper) for hver individuel responder og non-responder patient; de resulterende værdier vil derefter blive sammenlignet i de to grupper af patienter.
• På et andet analyseniveau vil kvalitative forskelle i T-cellereaktivitet mellem responderende og ikke-responderende patienter blive vurderet med hensyn til multifunktionalitet og multispecificitet af HCV-specifikke T-celleresponser ved at sammenligne ekspressionen af ​​hver enkelt funktion separat. (IL2, IFN-g, TNF-a) og kapaciteten af ​​hvert enkelt HCV-protein til at inducere T-celleresponser i de to grupper af patienter.

Karakterisering af HCV-specifikke T-celleresponser.

1. For at analysere global CD4+ og CD8+ reaktivitet mod strukturelle og ikke-strukturelle HCV proteiner, vil et omfattende panel af overlappende 15-mer peptider, der dækker hele HCV (genotype 1) sekvensen blive brugt; T-celleresponser vil blive analyseret ved flowcytometrisk intracellulær cytokinfarvning (ICS) for IFN-g, IL-2 og TNF-a og for degranulering (opregulering af CD107) in vitro (efter 10 dages peptidstimulering) og vha. Elispot for IFN-g ex-vivo (efter kortvarig peptidstimulering); syntetiske peptidepitoper med HLA klasse I- og klasse II-begrænsede specificiteter og kendt for at være målene for CD8+- og CD4+-responser mod forskellige HCV-ikke-relaterede vira og patogener (CMV, EBV, FLU) vil blive brugt som kontroller.
2. For yderligere at analysere CD8+ T-cellereaktivitet vil HLA-A2/peptid-dextramerer indeholdende nogle af de mest almindeligt anerkendte HLA-A2-begrænsede epitoper af HCV blive brugt i HLA-A2+-patienter til at kvantificere cirkulerende virus-specifikke CD8+-celler og måle ekspansionskapacitet vha. sammenligning af dextramer-positive CD8+-cellefrekvenser ex-vivo og efter 10 dages peptidstimulering.
3. Hos non-responder patienter, der viser fremkomsten af ​​resistensmutationer, vil specifikke peptider svarende til variantsekvenserne blive syntetiseret og brugt til at analysere, om nye mutationer kan påvirke HCV-specifik T-celle aktivering og funktion. Til dette formål vil den stimulerende effekt på forskellige T-cellefunktioner af prototype- og variantpeptider (cytokinproduktion, cytotoksicitet, udvidelseskapacitet) blive sammenlignet

Sekundære endepunkter

1. Analyse af yderligere immunpopulationer og serumfaktorer, der vides at være relevante med hensyn til kontrol af virusinfektion og modulering af T-celleresponser.

   • Natural Killer (NK) celleanalyse: NK celle fænotype vil blive undersøgt ved at vurdere ekspressionen af ​​specifikke markører, såsom CD16, NKG2A/D, TRAIL, NKP46/NKP30, Ki67, CD38/HLA-DR ved flowcytometri; NK-cellefunktion vil blive undersøgt ved at teste IFN-g/TNF-a-produktion og CD107-degranulering efter PBMC-inkubation natten over med passende stimuli.
   • Analyse af T regulatoriske celler (Treg): frekvens, fænotype og funktion vil blive undersøgt på hele PBMC'er co-farvet med CD3, CD4, CD25, FoxP3 og CD45RA.
   • Serumkoncentration af cytokiner, kemokiner og ISG, herunder IL15, IL6, CXCL9, CXCL10, IFN-g og IL28, vil blive analyseret i patienternes sera ved hjælp af Luminex-teknologien.
2. Identifikation af baseline-prædiktorer for manglende respons på DAA-terapi Belysning af virkningen, som det anti-virale immunrespons kan have ved ikke-respons på behandlinger med eller uden proteasehæmmere