Papel da imunidade do hospedeiro na não resposta à terapia direta com agente antiviral (DAA)

Objetivo e hipótese do estudo A hipótese subjacente ao projeto é que o nível de disfunção imune antiviral na infecção crônica pelo VHC é um fator causal que pode influenciar a não resposta à terapia. No entanto, informações sobre as características das respostas individuais de células T antivirais expressas por pacientes VHC crônicos virgens antes de iniciar a terapia DAA em relação ao resultado subsequente do tratamento e seu possível impacto na falha no controle da infecção não estão disponíveis. Os poucos resultados disponíveis sobre as respostas imunes anti-HCV na infecção crônica pelo HCV foram gerados em pacientes tratados com regimes DAA que não estão incluídos nas presentes diretrizes sem avaliação de acordo com o resultado. O objetivo do presente estudo será, portanto, entender se a não resposta à terapia está associada a uma disfunção imune antiviral mais ampla e profunda, comparando as respostas individuais de células T específicas do HCV em dois grupos de pacientes respondedores e não respondedores. A suposição feita é que possíveis defeitos de respostas de células T associados à falha em responder à terapia com DAA não devem ser substancialmente modificados por um tratamento ineficaz que permita caracterizar o histórico imunológico de pacientes não responsivos após o término de um ciclo ineficaz de terapia e comparar os resultados com as respostas pré-tratamento de linha de base de pacientes virêmicos virêmicos que subsequentemente eliminaram o vírus. Uma análise pré-tratamento também para pacientes não responsivos exigiria o recrutamento de um grande número de pacientes virgens para identificar um número suficiente de pacientes não responsivos, tornando o estudo inviável e excessivamente longo. Com esta estratégia, o recrutamento será muito rápido porque se espera que a maioria dos pacientes inscritos na linha de base sejam responsivos, enquanto os pacientes não responsivos que serão estudados após o término da terapia e após um período adequado de wash-out de 6 a 12 meses e antes iniciar retratamento já foram identificados nos Centros colaboradores e estarão prontamente disponíveis para o estudo assim que o protocolo for aprovado. Com base nos resultados, o possível objetivo de análises futuras pode ser caracterizar ainda mais em nível molecular os defeitos funcionais das células T de pacientes não respondedores para definir se e por quais estratégias sua correção pode representar uma abordagem viável para induzir/restaurar um anti -resposta viral para complementar e potencializar o efeito dos DAA de última geração. Por fim, a caracterização da imunidade protetora em pacientes não respondedores poderia permitir identificar preditores basais de não resposta à terapia a serem utilizados na prática clínica diária.

Histórico do estudo A taxa de resposta viral sustentada (SVR) em pacientes não cirróticos virgens tratados com DAAs sem IFN está entre 95% e 100%, mas a taxa de resposta é menor em subgrupos específicos de pacientes, incluindo cirróticos de genótipo 3 e pacientes com cirrose descompensada, independentemente do genótipo infectante. A alta eficácia das terapias baseadas em DAA é confirmada em coortes do mundo real, que mostram uma taxa de RVS apenas ligeiramente menor do que os estudos de registro. Embora a taxa de falha na terapia com DAA seja bastante limitada (cerca de 5%), espera-se que o número total de pacientes não responsivos seja alto devido ao alto número de pacientes cronicamente infectados pelo VHC que precisam de tratamento. A falha do tratamento resulta mais frequentemente em recaída e, menos frequentemente, em surto viral durante o tratamento. Acredita-se que diferentes fatores estejam implicados na não resposta à terapia, incluindo o surgimento de mutações de resistência, tratamento subótimo devido à definição incorreta do genótipo e doença hepática avançada.

O papel dos RAVs na linha de base na determinação da falha do tratamento ainda é debatido e o teste de resistência na linha de base parece ter utilidade clínica limitada. Em vez disso, o surgimento de RAVs durante regimes baseados em DAA e seu papel na determinação da falha virológica está bem documentado. Mesmo que variantes resistentes a medicamentos sejam detectadas em uma grande proporção de pacientes não responsivos, seu papel na diminuição da eficácia do tratamento não é totalmente claro.

A utilização de ensaios comerciais de segunda geração atualmente disponíveis para genotipagem do VHC reduziu o risco de erros de classificação genotípica, mas ainda é possível a possibilidade de infecções mistas com percentual de diferentes genótipos/subtipos abaixo da sensibilidade dos métodos aplicados na prática clínica causa de não resposta à terapia devido ao tratamento subótimo.

O surgimento de cepas resistentes e o tratamento abaixo do ideal devido à detecção incorreta do genótipo podem, no entanto, explicar apenas parte dos casos de falha do tratamento e fatores relacionados ao hospedeiro podem desempenhar um papel, em particular a resposta imune antiviral. De fato, sabe-se que as respostas imunes inata e adaptativa são profundamente prejudicadas na infecção crônica pelo HCV, mas informações muito limitadas estão disponíveis sobre a possível contribuição que as respostas imunes de base podem dar ao resultado final do tratamento DAA. Em contraste com as terapias baseadas em PegIFN, estudos recentes em pacientes tratados com DAA indicam que a frequência e a função das células CD8 específicas do HCV podem aumentar sob terapias livres de IFN com reversão parcial de seu fenótipo esgotado. Além disso, a terapia com DAA pode modular o compartimento das células NK, corrigindo o fenótipo ativado pelas células NK, que é típico de pacientes crônicos com HCV. Assim, o nível de comprometimento basal da imunidade antiviral pode influenciar a probabilidade subsequente de restauração imune após terapia com mais chances de resistência ao tratamento com DAA quando a inibição imunológica basal é mais profunda e ampla. Essa hipótese precisa ser testada.

Desfechos primários O objetivo do estudo será comparar a intensidade (níveis totais de funções antivirais) e a qualidade (multiespecificidade e multifuncionalidade) da resposta geral das células T específicas do VHC em pacientes não respondedores (com e sem variantes associadas à resistência - RAVs) e respondem à terapia DAA. Para atingir esse objetivo, as respostas mediadas por CD4 e CD8 serão avaliadas usando peptídeos sintéticos sobrepostos cobrindo o proteoma geral do HCV do genótipo 1, a fim de caracterizar a reatividade das células T a todas as proteínas do HCV, em termos de produção de citocinas (IL2, IFN- g e TNF-a) e potencial citotóxico (desgranulação de CD107).

• Como desfecho primário, a intensidade geral das respostas das células T será avaliada em pacientes respondedores e não respondedores; a intensidade total da reatividade de células T individuais será definida pela soma dos diferentes parâmetros de células T analisados ​​(produção de citocinas e citotoxicidade, conforme detectado em células CD3 totais e subconjuntos de CD4/CD8) para cada paciente respondedor e não respondedor individual; os valores resultantes serão então comparados nos dois grupos de pacientes.
• Em um segundo nível de análise, as diferenças qualitativas na reatividade das células T entre pacientes respondedores e não respondedores serão avaliadas em termos de multifuncionalidade e multiespecificidade de respostas de células T específicas do HCV, comparando a expressão de cada função individual separadamente (IL2, IFN-g, TNF-a) e a capacidade de cada proteína individual do HCV induzir respostas de células T nos dois grupos de pacientes.

Caracterização de respostas de células T específicas de HCV.

1. Para analisar a reatividade global de CD4+ e CD8+ contra proteínas estruturais e não estruturais do HCV, será utilizado um painel abrangente de peptídeos 15-mer sobrepostos cobrindo toda a sequência do HCV (genótipos 1); As respostas das células T serão analisadas por coloração de citocinas intracelulares (ICS) por citometria de fluxo para IFN-g, IL-2 e TNF-a e para degranulação (up-regulation de CD107) in vitro (após 10 dias de estimulação peptídica) e por Elispot para IFN-g ex-vivo (após estimulação peptídica de curta duração); Epítopos de peptídeos sintéticos com especificidades restritas a HLA classe I e classe II e conhecidos por serem alvos de respostas CD8+ e CD4+ contra diferentes vírus e patógenos não relacionados ao HCV (CMV, EBV, FLU) serão usados ​​como controles.
2. Para analisar ainda mais a reatividade das células T CD8+, dextrâmeros HLA-A2/peptídeo contendo alguns dos epítopos restritos HLA-A2 mais amplamente reconhecidos do HCV serão usados ​​em pacientes HLA-A2+ para quantificar células CD8+ específicas do vírus circulante e para medir a capacidade de expansão por comparando as frequências de células CD8+ positivas para dextrâmero ex-vivo e após 10 dias de estimulação peptídica.
3. Em pacientes não respondedores que apresentem o surgimento de mutações de resistência, peptídeos específicos correspondentes às sequências variantes serão sintetizados e usados ​​para analisar se mutações emergentes podem influenciar a ativação e função das células T específicas do HCV. Para tanto, será comparado o efeito estimulatório em diferentes funções das células T de peptídeos protótipos e variantes (produção de citocinas, citotoxicidade, capacidade de expansão).

Pontos finais secundários

1. Análise de populações imunes adicionais e fatores séricos conhecidos por serem relevantes no que diz respeito ao controle da infecção viral e modulação das respostas das células T.

   • Análise de células Natural Killer (NK): o fenótipo das células NK será estudado avaliando a expressão de marcadores específicos, como CD16, NKG2A/D, TRAIL, NKP46/NKP30, Ki67, CD38/HLA-DR por citometria de fluxo; A função das células NK será estudada testando a produção de IFN-g/TNF-a e degranulação de CD107 após incubação noturna de PBMC com estímulos apropriados.
   • Análise de células T reguladoras (Treg): frequência, fenótipo e função serão estudados em PBMCs inteiros co-corados com CD3, CD4, CD25, FoxP3 e CD45RA.
   • A concentração sérica de citocinas, quimiocinas e ISG, incluindo IL15, IL6, CXCL9, CXCL10, IFN-g e IL28, será analisada no soro dos pacientes pela tecnologia Luminex.
2. Identificação de preditores basais de não resposta à terapêutica com DAA Esclarecimento do impacto que a resposta imunitária antiviral pode ter na não resposta a terapêuticas com ou sem inibidores da protease