Hodowla i charakterystyka krążących komórek nowotworowych (CTC) w czerniaku i innych nowotworach (CTC)

Ustalono silną korelację między CTC a progresją raka piersi, okrężnicy i prostaty. Liczba CTC wydaje się działać jako marker prognostyczny nawrotu i przeżycia w wielu nowotworach nabłonkowych. Niestety, obecne testy CTC nie są skuteczne w niezawodnym wykrywaniu krążących komórek czerniaka, a procedury testowe uszkadzają komórki, uniemożliwiając dalsze badania.

To badanie ma na celu ocenę czułości i swoistości testu TrueCells, nowatorskiego podejścia do izolowania i zabezpieczania komórek do dalszych badań.

Główne cele:

• Ocena wykonalności i odtwarzalności izolacji CTC przy użyciu technologii TrueCells.
• Zoptymalizuj ilościowe odzyskiwanie CTC
• Dostarczenie wstępnych danych dotyczących korelacji tych pomiarów z innymi metodami odzyskiwania CTC, takimi jak immunofluorescencja, barwienie na bazie lipidów.

Cele drugorzędne:

• Zbadaj korelację testu immunofluorescencyjnego CTC i hodowli TrueCells CTC z odpowiedzią na leczenie według kryteriów obiektywnych i odpowiedzi immunologicznej, przeżycia wolnego od progresji choroby, punktów zwrotnych dotyczących przeżycia 1 i 2 lat oraz przeżycia całkowitego u pacjentów z rakiem.
• Próba wyizolowania długoterminowych linii komórek nowotworowych w celu oceny mutacji genów somatycznych oraz wzorców ekspresji genów i białek związanych z poszczególnymi nowotworami (nie ma na celu identyfikacji mutacji rodzinnych lub dziedzicznych) oraz w celu przetestowania wrażliwości na leki i biologię.
• Wyizoluj RNA i DNA z osocza, aby ocenić ekspresję markerów specyficznych dla guza (np. tyrozynaza, B-FRAF, V600E itp.) i genów związanych z przerzutami (np. MSH-1, syntaza tymidylanowa itp.).
• Przeprowadzaj ciągłe testy rozwojowe, aby nadal rozwijać i optymalizować nowe podejścia techniczne, aby ułatwić izolację nienaruszonego CTC.

Metody:

Próbki krwi będą pobierane od pacjentów z czerniakiem (200), rakiem prostaty (200), innymi nowotworami litymi (do 400), łagodnymi chorobami hematologicznymi (100) i zdrowymi ochotnikami (do 100). Od wybranych pacjentów podczas progresji choroby lub odpowiedzi na leczenie zostaną pobrane sekwencyjne próbki, aby umożliwić zbadanie potencjalnej korelacji CTC z odpowiedzią na leczenie, przeżyciem bez progresji i całkowitym przeżyciem. Próbki zostaną natychmiast pozbawione elementów umożliwiających identyfikację i opatrzone kodem numerycznym, opatrzone datą i wysłane do firmy TrueCells, LLC. Po przekazaniu własność próbki przechodzi na firmę TrueCells, LLC.

Badania naukowe obejmują:

• CTC zliczono niezależnie za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego grubego rozmazu przygotowanego z całego kożuszka leukocytarnego z dwóch probówek z krwią (probówki 1 i 2), wybarwionego odpowiednim pierwotnym przeciwciałem monoklonalnym pannowotworowym lub markerami lipidowymi z potwierdzającymi przeciwciałami wtórnymi w celu wykluczenia niezamierzonego włączenia leukocytów i komórek śródbłonka podzbiory i zweryfikować rozpoznanie raka pacjenta.
• Leukocyty (zawierające CTC) wyizolowano przez wirowanie w gradiencie gęstości. Kożuszek leukocytarno-płytkowy jest wysiewany na zastrzeżoną pożywkę do hodowli komórkowej TrueCells, a komórki nowotworowe hodowane i namnażane (probówki 3 i 4). Kolonie komórek zliczono i porównano z liczbą kolonii zidentyfikowanych przez barwienie immunofluorescencyjne.
• W niektórych przypadkach CTC można hodować jako długoterminowe linie komórkowe. Komórki te mogą zostać poddane dalszej analizie, takiej jak ocena mutacji genów somatycznych, jak również wzorców ekspresji genów i białek w celu identyfikacji cech poszczególnych nowotworów oraz wrażliwości na leki i czynniki biologiczne. Mogą istnieć dodatkowe przyszłe eksperymentalne zastosowania in vitro dla tych pozbawionych identyfikacji linii komórkowych wczesnego pasażu, które nie zostały jeszcze zidentyfikowane lub przewidziane w tym zastosowaniu.
• Osocze (produkt uboczny procesu izolacji leukocytów z probówek 3 i 4) zostanie pobrane i tymczasowo zamrożone w celu izolacji DNA i RNA do testów molekularnych markerów molekularnych czerniaka i ekspresji genów przerzutów. Próbki te są zużywane w procedurze testowej.

Informacje kliniczne zostaną wyodrębnione z dokumentacji medycznej, pozbawione elementów umożliwiających identyfikację i przechowywane w arkuszu kalkulacyjnym chronionym hasłem. Informacje, które należy zebrać, obejmują wiek, płeć, status T, N, M, inne schorzenia, stężenie LDH w surowicy, wszelkie specyficzne markery nowotworowe (np. PSA), krążące komórki nowotworowe (jeśli są analizowane za pomocą komercyjnego testu), somatyczne mutacje genetyczne obecne w raku (np. B-RAF V600E u pacjentów z czerniakiem) częstość mitotyczna guza, data rozpoznania guza, historia leczenia, data progresji regionalnej i przerzutowej oraz data zgonu (jeśli dotyczy).