COVID-19 na temat ekspresji genów łożyska i patologii (PROSPER)

Obecna epidemia COVID-19, choroby wywołanej przez koronawirus 2 ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS-CoV-2), ma podobieństwa do wybuchu choroby SARS (2002–2003) i trwającej na Bliskim Wschodzie choroby układu oddechowego Epidemia zespołu MERS, która rozpoczęła się w 2012 r. Wszystkie trzy infekcje objawiają się kaszlem, gorączką i możliwością wystąpienia choroby dolnych dróg oddechowych. Podczas gdy SARS i MERS utrzymują wyższy wskaźnik śmiertelności przypadków (CFR), wyższa zdolność przenoszenia się Covid-19 skutkuje większą liczbą przypadków i zgonów. Ciężkie infekcje dróg oddechowych, które często prowadzą do zapalenia płuc, takie jak SARS i grypa A H1N1, wiążą się ze zwiększonym ryzykiem śmiertelności matek i urodzenia martwego dziecka. Chociaż obecne dowody nie wskazują na większe ryzyko zakażenia u matki niż w populacji ogólnej, niewiele wiadomo na temat wpływu zakażenia na ciążę i niekorzystne wyniki dla noworodka. Systematyczny przegląd infekcji ze spektrum koronaawirusa wykazał 11% wzrost wskaźnika zgonów okołoporodowych. Dokładne mechanizmy zgonów okołoporodowych nie są dobrze scharakteryzowane.

Chociaż jak dotąd niewiele jest dowodów sugerujących, że zakażenie SARS-CoV-2 przenosi się wertykalnie na płód, enzym konwertujący angiotensynę 2 (ACE2), potwierdzony receptor SARS-CoV-2, wykryto w dużych ilościach we wczesnym łożysko ludzkie i ma specyficzne dla tkanki wzorce aktywności. Kosmkowe komórki cytotrofoblastu i syncytiotrofoblastu wykazują wysoki poziom ekspresji ACE2 w pierwszym trymestrze ciąży, podczas gdy ekspresja w zewnętrznej warstwie trofoblastu zaczyna się na niskim poziomie we wczesnej ciąży, a następnie osiąga szczyt około 24 tygodnia ciąży. Zakłócenie unaczynienia i (lub) zdolności metabolicznej łożyska może skutkować niewydolnością łożyska oraz nieoptymalnym wzrostem i rozwojem płodu. Wcześniejsze badanie dotyczące łożyska u pacjentek z COVID-19 wykazało wzrost częstości występowania arteriopatii końcowej i wzorców malperfuzji naczyniowej u matki (MVM), z których wiele było bezobjawowych w związku z COVID-19. Dodatkowo u części pacjentek chorych na COVID-19 w czasie ciąży wystąpi zapalenie płuc, a w konsekwencji niedotlenienie. Stawiamy hipotezę, że narażenie na hipoksemię i niewydolność oddechową matki może dodatkowo zagrozić wymaganiom metabolicznym jednostki płodowo-łożyskowej podczas ciąży.

Naszą główną hipotezą badawczą jest to, że choroba Covid-19 wpływa na rozwój i funkcję łożyska oraz że zależy od ciężkości i czasu trwania choroby. Stawiamy hipotezę, że wpływ na rozwój łożyska spowoduje następnie zwiększenie niekorzystnych wyników dla płodu.

Jest to projekt badawczy mający na celu kontrolę przypadków, w którym wykorzystane zostaną dane pacjentów (w tym historia choroby) i próbki łożyska pobrane w szpitalu Greenville Memorial Hospital w okresie od czerwca 2020 r. do czerwca 2021 r. podczas wybuchu epidemii COVID-19. Kontrole będą dopasowywane na podstawie przechowywanych w banku próbek krwi łożyskowej i krwi pępowinowej pobranych w szpitalu Greenville Memorial Hospital lub systemie opieki zdrowotnej Northshore University Health przed pojawieniem się epidemii COVID-19, w okresie od marca 2017 r. do grudnia 2019 r. Planujemy wykorzystać próbki przechowywane w banku, biorąc pod uwagę potencjalnie wysoki odsetek przypadków bezobjawowych. Na zakończenie badania próbki i dane zebrane w szpitalu Greenville Memorial Hospital zostaną poddane deidentyfikacji i połączone z próbkami pobranymi w Centrum Zdrowia Uniwersytetu NorthShore w celu późniejszej analizy i publikacji.

Potencjalnie kwalifikujące się pacjentki zostaną zidentyfikowane podczas rutynowej opieki prenatalnej w ośrodku położniczym/ginekologicznym Prisma Health, w rejestrze Prisma Health COVID-19 lub podczas przyjęcia do szpitala Greenville Memorial w celu porodu. Kwalifikowalność pacjentów zostanie oceniona na podstawie przeglądu dokumentacji medycznej. Pacjentki zidentyfikowane przed przyjęciem do szpitala można wyrazić zgodę podczas następnej wizyty w ramach opieki prenatalnej w ośrodku położniczym/ginekologicznym, na oddziale medycyny matczyno-płodowej lub po przybyciu do szpitala Greenville Memorial w celu porodu. Pacjentki zidentyfikowane jako kwalifikujące się przed przyjęciem do szpitala w celu porodu zostaną oznaczone jako kwalifikujące się w zakładce Badania w ich karcie. Pacjentki zidentyfikowane przed przyjęciem do szpitala można wyrazić zgodę i zapisać na następną wizytę w ramach opieki prenatalnej w ośrodku położniczym/ginekologicznym, oddziale medycyny matczyno-płodowej lub po przybyciu do szpitala Greenville Memorial w celu porodu.

Podczas rejestracji pacjenci odpowiedzą na krótki kwestionariusz dotyczący danych demograficznych i objawów COVID. W momencie porodu zostaną pobrane próbki łożyska i krwi pępowinowej w celu oceny molekularnej i histologicznej stanu zapalnego. Przeszkolone pielęgniarki, personel rezydentów i/lub badacze pobiorą i przetworzą te próbki. Ponieważ kosmki rozwijają się klonalnie, ekspresja genów może skupiać się przestrzennie. Aby zminimalizować wpływ tych różnic, personel pobierze biopsje o objętości 0,4 cm3 z czterech oddzielnych liścieni w każdym łożysku i zawiesi tkankę w środku stabilizującym (AllProtect Tissue Reagent, Qiagen). Zdezidentyfikowane biopsje łożyska zostaną podzielone na partie i wysłane do laboratorium dr Grega Millera na Uniwersytecie NorthShore w Chicago, Illinois, gdzie zostaną przygotowane do analizy obejmującej regulację transkrypcji łożyska. Zidentyfikowane próbki łożyska zostaną wysłane do Centrum Genomiki Społecznej na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles, gdzie zmierzona zostanie regulacja transkrypcji odzwierciedlona w ekspresji mRNA i miRNA. Z niezidentyfikowanych próbek technicy firmy Core wyekstrahują RNA przy użyciu zestawów Qiagen RNeasy Mini Kit i przeprowadzą kontrolę jakości za pomocą stacji Agilent TapeStation. 500 ng RNA zostanie przekształcone w cDNA (Illumina TruSeq Stranded Total RNA RiboZero Globin) i zsekwencjonowane na instrumencie Illumina HiSeq 4000, przy użyciu protokołów optymalnie wykrywających mRNA i miRNA. > 50 milionów odczytów sekwencji na próbkę zostanie zmapowanych do ludzkiego genomu RefSeq (hisat2/stringtie) i znormalizowanych do liczby transkryptów na milion zmapowanych odczytów dla każdego aktualnie opatrzonego adnotacją mRNA i miRNA. Wyszkolony patolog w Greenville Memorial przeprowadzi dokładne badanie łożyska i przygotuje kasety do późniejszej oceny histologicznej. Z laboratorium patologicznego zostaną pobrane zdezidentyfikowane preparaty łożyska, które następnie zostaną wysłane do NorthShore, gdzie patolog okołoporodowy potwierdzi ustalenia patologiczne. W szczególności wybarwione hematoksyliną i eozyną skrawki błon, płytki podstawnej i miąższu kosmków o grubości 5 μm zostaną zbadane pod kątem ostrych i przewlekłych zmian zapalnych w trzech głównych przedziałach łożyska: błonach, miąższu kosmków i blasze podstawnej. Patolog okołoporodowy w Northshore dodatkowo zbada tkankę łożyska pod kątem COVID-19, używając barwień immunohistochemicznych. Zostaną sporządzone karty medyczne dotyczące wyników ciąży i powikłań. W szczególności uwzględnimy historię położniczą i medyczną, w tym porodowość, historię problemów zdrowotnych i przebieg porodu, wskaźnik masy ciała przed ciążą, wyniki doustnych testów tolerancji glukozy i badań przesiewowych w kierunku cukrzycy ciążowej, rozpoznanie cukrzycy, nadciśnienia, stanu przedrzucawkowego i chorób zakaźnych podczas obecnej ciąży. Dane dotyczące porodu będą obejmować metodę porodu i czas trwania porodu, a także płeć płodu, masę ciała, długość i wiek ciążowy. Dwóch programistów, ślepych na inne dane, wyodrębni każdy rekord i rozwiąże rozbieżności w drodze konsensusu. Po zebraniu określonych danych nie będą już prowadzone żadne dalsze badania dokumentacji medycznej. Innymi słowy, nie planujemy dalszego wyciągania informacji na temat zdrowia matki i dzieci w miarę upływu czasu. Gdybyśmy chcieli to rozpocząć, zwrócilibyśmy się do IRB o wskazówki dotyczące tego, jak uzyskać odpowiednią zgodę uczestników na takie działania. Przewidujemy, że badanie będzie trwało ponad rok. Uczestniczki zostaną zaangażowane w proces porodu, a ich dokumentacja medyczna zostanie sprawdzona od momentu ciąży do 6 tygodni po porodzie.