NIPD em cffDNA para Doenças de Repetição Tripla

Contexto:

A capacidade de sequenciar cfDNA fetal levou a novos e empolgantes desenvolvimentos para o diagnóstico genético não invasivo de doenças monogênicas (DPNI_MGR). Vários testes são propostos para doenças com mutações predominantemente de novo dominante, paterna dominante e algumas mutações paternas recessivas. No entanto, persistem dificuldades técnicas relacionadas com a determinação do equilíbrio alélico materno, em particular durante o faseamento dos haplótipos parentais de acordo com uma estratégia trio que requer a disponibilidade de ADN genómico parental e pelo menos uma criança saudável ou afetada. Além disso, os sequenciadores de 2ª geração não permitem a haplotipagem de alelos portadores de mutações dinâmicas.

Objetivos.

Este projeto propõe a validação de um teste DPNI_MGR semi-universal aplicável à maioria dos genes e mutações envolvidos em solicitações de DPN a partir do faseamento de haplótipos parentais por técnicas de sequenciamento de DNA de fragmento longo de 3ª geração, juntamente com sequenciamento direcionado de DNA circulante livre do plasma materno . Este teste será validado usando doenças de expansão trigêmea, que são a segunda indicação de DPN a nível nacional.

Metodologia:

Estudo retrospectivo de 16 casais em risco de transmissão de uma doença com expansões trigêmeas (distrofia miotônica de Steinert, doença de Huntington, FRAXA, SCA1, 2, 3)

Fase 1 :

• Determinação de 8 pares de haplótipos parentais de acordo com a técnica "Nanopore Cas9 Targeted-Sequencing" (nCATS) e validação dos parâmetros analíticos e qualidade deste método (taxa de cobertura das regiões de interesse, taxa de erro, identificação do alelo mórbido portador a expansão ...),
• Comparação dos haplótipos parentais obtidos na técnica "Nanopore" versus os obtidos pela técnica "Linked Reads 10xGenomics" nestes mesmos 8 pares (os dados de sequenciamento e faseamento por esta 2ª abordagem estão disponíveis em um estudo anterior),
• Avaliação da concordância dos resultados do genótipo fetal obtidos durante o exame padrão (DPN por amniocentese ou coriocentese) e os obtidos com essas novas abordagens de faseamento em PNID.

Fase 2:

- Validação do fluxo de trabalho de melhor desempenho (eficiência/custo) da fase 1 em 8 pares adicionais para uma transferência clínica da abordagem.

Resultados esperados e perspectivas:

Este estudo deverá permitir definir o teste de melhor desempenho para o DPNI de doenças de expansão triplete de acordo com o conhecimento da técnica e validar as condições de transferência na prática clínica da abordagem (equipamentos, reagentes, análise de custos, critérios de validação analítica ....).

O fluxo de trabalho validado deve ser o mais universal possível para fornecer acesso secundário a nível nacional a uma ampla gama de doenças raras NIDP por ajustes futuros do conteúdo genético dos painéis de sequenciamento de DNA de circulação livre.