Analýza distribuce regulačních B buněk v krvi pacientů s roztroušenou sklerózou (B-MS)

Roztroušená skleróza (RS) je progresivní imunozánětlivé a degenerativní onemocnění centrálního nervového systému (CNS) a představuje druhou nejčastější příčinu invalidity u mladých lidí. Zapojené patofyziologické mechanismy jsou složité a účinné terapeutické strategie musí být ještě definovány. Navíc je dnes zřejmé, že léčebné přístupy musí být prováděny z osobního hlediska. V této souvislosti jsou u RS zvláště potřebné biomarkery hodnotící průběh onemocnění, ale také predikující účinnost terapie.

Nedávné údaje zdůrazňují přímou roli B-buněk v RS. Taková komplexní data vedla k novým terapeutickým strategiím využívajícím bioterapie za účelem vyčerpání nebo modulace funkcí periferních B buněk. Takové přístupy vedly k protichůdným výsledkům účinnosti. Dnes zůstává nejasné, zda B-buňky vykazují snížené regulační účinky nebo místo toho potencují patogenní odpověď T-buněk. Takové duální vlastnosti mohou záviset na uvolňování inhibitoru (např. interleukin-10) nebo prozánětlivé cytokiny (např. interleukin-6) a/nebo přímé interakce s jinými buňkami, zejména T buňkami.

Cílem výzkumníků je longitudinálně vyhodnotit kvantitativní a funkční změny v podskupinách B-buněk periferní krve (1) v iniciačních fázích RS, tj. radiologický izolovaný syndrom (RIS) a klinicky izolovaný syndrom (CIS) (2) během progrese RS a ( 3) mezi dvěma klinickými formami RS u dosud neléčených pacientů: Relapsující-Remitentní RS (RRMS) a Primárně progresivní RS (PPMS). Podskupiny B-buněk jsou definovány kombinací membránových markerů a počítány v různých časových bodech (zařazení (před léčbou) a po 3, 6, 12, 24 měsících zahájení léčby) v cytometrické analýze plné krve (FCM). Absolutní počty a relativní podíly přechodných, naivních, paměťových a podskupin B-buněk podobných marginálním zónám jsou prospektivně sledovány u pacientů s radiologicky izolovaným syndromem (RIS, n= 20), s klinicky izolovaným syndromem (CIS, n = 20), u pacientů s RS s relabující remitující formou (RRMS, n = 20) au pacientů s RS s primárně progresivním vývojem onemocnění (PPMS, n = 20). Kontrolní vzorky jsou odebírány od pacientů postižených jinými zánětlivými onemocněními s neurologickými příznaky (Devic syndrom, Neurobehcet, neurosarkoidóza n = 20) nebo bez neurologických příznaků (systémová skleróza, SSc, n = 20) a od dárců krve (n = 40). Aby bylo možné vyhodnotit funkční vlastnosti B lymfocytů, jsou mononukleární buňky periferní krve (PBMC) z každé skupiny pacientů aktivovány CD40 ligandem a CpG oligodeoxynukleotidy (CpG ODN) a B lymfocyty produkující IL-10 jsou počítány pomocí FCM po a krátká inkubace s forbolmyristátacetátem, ionomycinem a brefeldinem A jako inhibitorem transportu proteinů. U vybraných pacientů s CIS a MS, jejichž změny v subpopulacích B-buněk spojené s nástupem nebo progresí onemocnění jsou reprezentativní, budou subpopulace B-buněk purifikovány a aktivovány ligandem CD40 a CpG ODN, aby byly kokultivovány s aktivovanými anti-CD3 autologní T-buňky k vyhodnocení inhibičních nebo potencujících účinků na produkci prozánětlivých cytokinů T-buňkami (např. IFN-gama, IL-17).

Všechny fenotypové analýzy a buněčné kultury se provádějí pomocí dříve ověřených protokolů. Naším konečným cílem je korelovat kvantitativní a funkční změny podskupin tvořících systémovou populaci B-buněk s gradingem a vývojem RS. Taková strategie by mohla vést k identifikaci, kteří pacienti s RS by měli dostat léčbu cílenou na B buňky a kdy. Dále může nabídnout zdůvodnění pro alternativní formy buněčné terapie, které by mohly zavést například autologní purifikované B regulační buňky po strategiích vyčerpání.