Statine per stress ossidativo e funzione mitocondriale nella polineuropatia diabetica

Introduzione La disfunzione del sistema nervoso nei pazienti con diabete è nota come neuropatia diabetica ed è considerata la complicanza microvascolare più diffusa - fino al 60% - nei soggetti con diabete mellito di tipo 2 (T2DM). La polineuropatia diabetica (DPN) comprende circa il 70% di tutti i casi. La sua diagnosi viene stabilita mediante punteggi convalidati basati su caratteristiche cliniche e studi di conduzione nervosa anormale (NCS). I risultati fisiopatologici includono la perdita di fibre nervose multifocali e focali secondaria a degenerazione assonale e demielinizzazione segmentale, fondamentalmente dovuta allo stress ossidativo indotto dall'iperglicemia cronica, che porta all'apoptosi neurale. Altri meccanismi coinvolti nella lesione dei nervi periferici sono lo stress nitrosativo indotto dall'ossido nitrico (NO).

L'ezetimibe diminuisce il contenuto di esteri del colesterolo nei chilomicroni riducendo l'assunzione di colesterolo da parte del fegato che di conseguenza aumenta l'assorbimento di LDL e la depurazione plasmatica; in monoterapia riduce il C-LDL del 17%. Quando combinato con simvastatina, la riduzione del colesterolo è potenzialmente aumentata; inoltre, gli effetti pleiotropici delle statine includono un aumento dell'attività del fattore nucleare kappa B e un miglioramento degli ioni superossido dopo 12 settimane di trattamento. Un altro inibitore dell'idrossi-metil-glutaril coenzima A, la rosuvastatina, ha un effetto antiossidante agendo come portatore di radicali liberi diminuendo la produzione di perossidazione lipidica mitocondriale e cellulare (LPO).

Abbiamo condotto questo studio per valutare l'effetto di ezetimibe/simvastatina e rosuvastatina sullo stress ossidativo nei pazienti con DPN.

Metodi Disegno dello studio Uno studio clinico di fase II randomizzato, in doppio cieco, controllato con placebo è stato condotto presso il Clinic and Experimental Therapeutics Institute, Università di Guadalajara, in Messico. I soggetti sono stati assegnati a tre trattamenti di gruppo in blocchi con una sequenza parallela 1:1:1 attraverso un elenco computerizzato randomizzato, generato da un diverso ricercatore ignaro dei farmaci somministrati. I pazienti sono stati divisi in: gruppo di controllo che ha ricevuto placebo, ezetimibe/simvastatina e rosuvastatina come singola dose giornaliera per 16 settimane. Il periodo di selezione è stato effettuato da febbraio 2012 a gennaio 2013. Abbiamo selezionato 5 soggetti sani non randomizzati (HS) da una banca del sangue per confrontare lo stato di stress ossidativo.

Popolazione in studio I criteri di inclusione erano ≥18 anni, T2DM secondo l'American Diabetes Association e DPN di Dyck et. criteri al.3, HbA1c <12% e consenso informato firmato. Sono stati esclusi in caso di insufficienza renale o epatica, gravidanza o allattamento, altre neuropatie (indotte da alcol, radicolopatia, autoimmuni, correlate al cancro) ed eliminati in caso di mancata aderenza al trattamento (<80% dell'assunzione di farmaci), grave reazione avversa al farmaco e/ o grave malattia di salute. I pazienti sono stati selezionati su invito nei forum; pazienti ambulatoriali reclutati da cliniche di cure primarie; e database raccolti in precedenza dal nostro Istituto dal febbraio 2010 al 2012. I pazienti sono stati istruiti a prendere i loro farmaci solo di notte alla stessa ora ogni giorno, come segue: placebo 100 mg, ezetimibe/simvastatina 10/20 mg e rosuvastatina 20 mg. Tutti i farmaci erano simili nelle caratteristiche fisiche e si presentavano in fiale scure, accuratamente riempite da un altro ricercatore del gruppo, che apponeva una rispettiva targhetta con il codice del paziente. Inoltre, ai pazienti veniva fornito un diario in cui annotavano la data e l'ora della somministrazione del farmaco e le reazioni avverse al farmaco avvertite. Tali informazioni sono state raccolte e registrate ogni 4 settimane. Gli esiti primari erano i marcatori di stress ossidativo LPO, NO e TAC prima e dopo l'intervento di 16 settimane. Gli esiti secondari erano i parametri clinici, NCS e metabolici [glicemia a digiuno, HbA1c, colesterolo totale, lipoproteine ​​ad alta e bassa densità (HDL, LDL) e trigliceridi]. Il profilo di sicurezza è stato valutato con reazioni avverse al farmaco, variabili di laboratorio renali (urea, creatinina) ed epatiche [(alamina e aspartato-aminotransferasi, gama-glutamiltransferasi, bilirubina e fosfochinasi).

Stress ossidativo e marcatori di funzione mitocondriale LPO è stato misurato secondo le specifiche del kit (Oxford Biomedical Research Inc., FR12), 200 μL di siero sono stati trattati con una sostanza cromogena che reagisce con la malondialdeide (MDA) e 4-idrossi-alchenali (HNA), l'assorbanza misurata a 586 nm e i risultati espressi in nmol/mL.

Previa deproteinizzazione dei campioni, abbiamo eseguito una colorimetria per la determinazione della concentrazione di NO con 85 µL di siero (Kit di analisi dell'ossido nitrico, protocollo utente 482650), con risultati espressi come pmol/mL.

La capacità antiossidante totale (TAC) è stata realizzata con 200 µL di siero, per ottenere valori di millimole (mM) equivalenti di acido urico (Total Antioxidant Power Kit, No. 02090130, Oxford Biomedical Research®).

Variabili cliniche e di conduzione nervosa Sintomi neuropatici (NSS) e punteggi di disabilità (NIS) descritti da Dyck, et. al. sono stati ottenuti dall'esame fisico e dall'anamnesi. Abbiamo anche misurato la latenza, la durata, l'ampiezza e la velocità di conduzione del nervo motore dai nervi fibula, tibiale, mediano e ulnae, e i parametri di sensibilità dai nervi surale, mediano e ulnae, come richiesto dall'American Association of Electrodiagnostic Medicine.

Considerazioni etiche Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico e di Ricerca del Centro Universitario di Scienze della Salute, Università di Guadalajara, Messico. A ciascun partecipante sono stati assegnati codici identificativi per garantire la riservatezza del paziente ed è stato firmato un modulo di consenso informato prima di entrare nel protocollo, secondo le leggi nazionali e internazionali, nonché come previsto dalle dichiarazioni di Helsinki (http://www.wma.net/ es/30 pubblicazioni/ 10 policies/b3/17c.pdf, accesso gennaio 2011).

Analisi statistica La dimensione del campione è stata ottenuta mediante una formula di progettazione di uno studio clinico tenendo conto di una differenza di variazione di 0,05 nmol/mL in LPO, intervallo di confidenza del 95%, potenza dell'80% e p<0,05 a due code, che ha portato a 21 per ciascuno gruppo. Le variabili quantitative sono state espresse come media ± deviazione standard. Sono stati eseguiti i test di Kolmogorov-Smirnov e Shapiro-Wilk per determinare la distribuzione non parametrica delle variabili. Sono stati realizzati i test di Friedman e Wilcoxon per le misurazioni prima e dopo, e Kruskal-Wallis con U di Mann-Whitney come analisi post-hoc per confronti tra gruppi. Le variabili qualitative sono state espresse come frequenze e percentuali. Il test del chi quadrato è stato utilizzato per valutare le differenze nelle variabili dicotomiche prima e dopo il trattamento, i confronti tra i gruppi sono stati determinati dal test esatto di Fisher e χ2 secondo necessità. Il livello di significatività è stato stabilito con un valore p <0,05.