Nukleární morfologie prsních buněk v duktální laváži

PROČ SE STUDIE DĚLÁ

Tekutiny z prsních bradavek (NAF) lze získat neinvazivně od žen, takže analýzy této tekutiny jsou relevantní pro studie rizika rakoviny prsu. Interindividuální variace pro produkty oxidace lipidů (typ poškození tuků) u NAF je více než 100násobná a tyto oxidační produkty mají pravděpodobně toxický účinek na epiteliální buňky prsu. Během výplachu prsních vývodů se nejprve odsaje NAF a vývody produkující tekutinu se poté podrobí výplachu, aby se získaly epiteliální buňky. Poté lze zkoumat jaderné znaky (morfologii) těchto buněk. Nukleární morfologie je kvantitativní metoda k pozorování jemných změn v jaderných rysech a tato měření v benigních biopsiích prsu mají prognostickou hodnotu pro riziko rakoviny prsu.

Tato průzkumná studie pomůže stanovit proveditelnost použití těchto opatření jako koncových bodů ve studiích dietních intervencí. Protože rozdíly v úrovních oxidace lipidů u NAF jsou výrazně velké, je rozumné se domnívat, že musí existovat určitý vliv na jadernou morfologii. Tato opatření by také měla být použitelná pro výzkumy, které se snaží prozkoumat dopad určitých genetických polymorfismů a environmentálních expozic na biomarkery oxidačního stresu a rizika rakoviny prsu.

Budeme studovat ženy, u kterých bylo dříve diagnostikováno proliferativní onemocnění prsu. Tyto ženy mohou být dobrými kandidáty na studie dietní prevence, protože jsou v poněkud zvýšeném riziku rakoviny prsu, podstupují jen málo po operaci k léčbě a bylo prokázáno, že mají vyšší hladiny oxidace lipidů v prsu než ženy bez takové diagnózy.

CO DOUFÁME, ŽE DOSÁHNEME

Doufáme, že určíme proveditelnost získání a analýzy jak NAF, tak epiteliálních buněk prsu od žen s benigním proliferativním onemocněním prsu. Tyto ženy jsou vystaveny zvýšenému riziku rakoviny prsu a složení NAF, který omývá vývody prsu, může ovlivnit morfologické rysy jader v buňkách epitelu prsu. Pokud jsou hladiny produktů oxidace lipidů vyšší u žen s velkými jádry (rizikový faktor pro rakovinu prsu), pak mohou být v budoucnu plánovány intervence, které snižují oxidační stres a riziko rakoviny.

Cíle jsou:

1. Zjistit, zda lze hladiny tuků, poškozených nebo oxidovaných tuků, oxidovaných nebo poškozených vitamínů a vitamínů (8-isoprostan, cholesterol, mastné kyseliny, tokoferoly, karotenoidy a 2,6-cyklolykopen-4,5-diol) kvantifikovat v NAF prsu získané před výplachem prsu. Hladiny v NAF budou porovnány s hladinami v krvi. Tato opatření byla zvolena na základě jejich potenciálního vztahu k příjmu ve stravě a úrovním oxidačního stresu, což je relevantní pro intervenční studie. Tokoferoly a karotenoidy jsou dietetické antioxidanty a některé mastné kyseliny se oxidují snadněji než jiné. Zdá se, že jak 8-isoprostan, tak 2,6-cyklolykopen-4,5-diol jsou markery oxidačního stresu.
2. Získat tekutiny z výplachu prsu od žen s proliferativním onemocněním prsu a charakterizovat jadernou morfologii epiteliálních buněk prsu v tekutině z výplachu prsu. Budeme kvantifikovat různá měření běžně používaná v biopsiích včetně průměru jádra, obvodu, plochy, kulatosti a poměru jader:cytoplazmatická plocha. Ukázalo se, že tato opatření souvisejí s rizikem rakoviny prsu. Pokud je dostatek buněk, bude provedena analýza oxidativního poškození DNA pomocí kometového testu.
3. Zkoumat, zda jaderná morfologie souvisí s úrovněmi oxidačního stresu v NAF. Budou hodnoceny korelace s hladinami 8-isoprostanu, cholesterolu, specifických mastných kyselin, 2,6-cyklolykopen-1,5-diolu a mikroživin rozpustných v tucích. Ve snaze lépe porozumět rozdílům mezi ženami v jaderné morfologii epiteliálních buněk z duktální laváže bude také zkoumán potenciální vliv stravy, demografických faktorů a povahy předchozí bioptické diagnózy na nukleární morfologii.

Materiály shromážděné pro výzkumné účely budou:

Formulář souhlasu Dotazník o zdravotním stavu Dotazník k jídlu Frekvence jídla Výška a tělesná hmotnost Tekutina nasátá z prsních bradavek Tekutina na výplach prsu 10 ml Datum biopsie vzorku krve, diagnóza a anamnéza zdravotních problémů z lékařské tabulky

VELIKOST VZORKU

Bylo žádoucí vybavit naši studii tak, aby mohly být sledované proměnné stanoveny v rámci variačního koeficientu (CV) 25 %, s 90% spolehlivostí. Šedesát subjektů by poskytlo odhady průměrné úrovně 8 z 9 proměnných studie v rámci CV 25 %, s 90% spolehlivostí. Jedinou výjimkou je vysoce variabilní měření 8-isoprostanu, jehož průměrnou hladinu lze odhadnout v rámci CV 37 %, s 90% spolehlivostí.

JAK BUDE STUDIE PROVÁDĚT

Do této studie bude klinickým lékařem přijato celkem 75 žen během zhruba 13 měsíců (deset měsíců roku 1 a 3 měsíce roku 2). Z pacientské tabulky potvrdí předchozí diagnózu proliferativního onemocnění prsu, zjistí typ diagnostikovaného onemocnění prsu, dobu, kdy bylo diagnostikováno s přesností na měsíc, a případné problémy s prsy nebo zdravotní problémy, které by mohly ovlivnit výsledky laváže. Subjekty studie vyplní dotazníky, budou zváženy a změřeny na výšku, darují 10ml vzorek krve a podstoupí proceduru výplachu prsou. Během výplachu bude odebrána tekutina z prsních bradavek a výplachová tekutina.

Výplach prsních kanálků je důležitý nový postup, který lze použít k určení rizika rakoviny prsu u ženy. Je to atraktivní diagnostická metoda, protože je spojena s velmi malým nepohodlím. V současné době se používá pouze u některých žen, u kterých se předpokládá, že mají velmi vysoké riziko rakoviny prsu. Během procedury duktální laváže musí být nejprve identifikovány kanály produkující tekutinu. To se provádí tak, že se nejprve uvolní kanálky na povrchu bradavek keratinových zátek a žena poté pomocí masáže vytvoří tekutinu. Tato tekutina, nazývaná tekutina z aspirátu bradavek (NAF), je to, co omývá prsní kanálky a bude shromažďována pro analýzu v tomto navrhovaném projektu. Jakmile jsou identifikovány vývody, které produkují NAF, lékař výplach potrubí provede. Výplachová tekutina vymyje prsní buňky, které pak může patolog vyhodnotit, aby určil, zda jsou nebo nejsou normální. Celý postup se provádí nejprve s použitím anestetika na povrchu bradavky a ve výplachové tekutině, aby se minimalizovalo jakékoli nepohodlí, a úrovně nepohodlí jsou obecně nižší než u mamografie.

Časným indikátorem rizika rakoviny prsu může být charakteristika epiteliálních buněk z výplachové tekutiny. Tyto prsní buňky se při laváži uvolní, umístí se na sklíčko a patolog je vyšetří na abnormality. Kromě patologické diagnózy mohou existovat jemné změny ve vzhledu buněk. Změny velikosti a tvaru buněčného jádra lze měřit pomocí počítačově řízeného mikroskopu, který má software pro kvantitativní analýzu obrazu. Je známo, že zvýšení jaderné plochy, průměru a obvodu a méně rovnoměrné zaoblení jader jsou spojeny s rakovinou prsu vyššího stupně. Tyto druhy měření byly také měřeny u biopsií prsu, které byly buď normální, nebo hyperplastické, a u žen s většími jádry ve zcela benigních biopsiích prsu byla větší pravděpodobnost vzniku rakoviny prsu o 1-33 let později.

Jedním z faktorů, který může ovlivnit tvar jader v buňkách prsu, je úroveň oxidačního stresu v prsu. Prsní tekutina je velmi bohatá na tuky neboli lipidy a některé druhy lipidů snadno oxidují. NAF také obsahuje vitamíny získané z ovoce a zeleniny, které fungují jako antioxidanty k zastavení oxidace lipidů. Například karotenoidy mohou reagovat se škodlivými oxidanty za vzniku oxidovaných karotenoidů. Budeme proto měřit hladiny jednoho markeru lipidové peroxidace a jednoho oxidovaného karotenoidu v NAF jako markerů oxidačního stresu. Budeme také měřit hladiny mastných kyselin a hladiny neoxidovaných karotenoidů. Poté určíme, zda rozdíly ve složení NAF souvisejí s mírami tvaru jádra provedenými na buňkách prsu.

NAF prsu a krev budou analyzovány na cholesterol pomocí spektrofotometrických souprav. Mastné kyseliny budou analyzovány pomocí plynové chromatografie. Celkové 8-isoprostany budou analyzovány imunoanalytickými soupravami. Mikroživiny a vitamíny budou analyzovány vysokotlakou kapalinovou chromatografií. Jaderná morfologie bude analyzována počítačem řízeným mikroskopem. Poškození DNA v buňkách prsu bude analyzováno pomocí gelové elektroforézy lyžovaných buněk (kometový test). Statistické analýzy nám umožní určit, zda NAF a měření krve souvisejí navzájem as jadernými měřeními.