Mio-inozytol, D-chiro-inozytol i glukomannan w PCOS

PROJEKT BADANIA Badanie ma charakter prospektywny i obserwacyjny. Kryteriami włączenia są: wiek od 18 do 35 lat, nadwaga/otyłość (BMI > 25 kg/m2), brak innych ostrych współistniejących lub przewlekłych chorób, dodatnie rozpoznanie PCOS zgodnie z kryteriami rotterdamskimi. Kryterium wykluczenia jest przyjmowanie leków hormonalnych lub leków wpływających na wrażliwość na insulinę (np. inozytoli lub metforminy) przed włączeniem do badania.

Zastosowanie mio-inozytolu (1,75 g), D-chiro-inozytolu (0,25 g) i glukomannanu (4,0 g)/die musi poprzedzać rekrutację nie więcej niż 30 dni. Decyzja o rozpoczęciu leczenia musiała zostać podjęta przed i niezależnie od rozpoczęcia badania. Stosowanie inozytolu i glukomannanu musi odbywać się zgodnie z kartą techniczną. W szczególności oczekuje się, że mio-inozytol (1,75 g), D-chiro-inozytol (0,25 g) i glukomannan (4,0 g) zostaną podzielone na dwie dawki przed głównymi posiłkami.

METODOLOGIA 4.1 Wizyta wstępna (V0) Po sprawdzeniu kryteriów kwalifikacji badacz podczas wizyty wstępnej (V0) poinformuje pacjenta o celach badania i uzyska pisemny formularz świadomej zgody.

Sporządzenie karty klinicznej zawiera informacje ogólne, wywiad, BMI, charakterystykę cyklu miesiączkowego, ilość krwawień miesiączkowych, stopień hirsutyzmu wg wskaźnika Ferrimana-Gallweya oraz stopień trądziku wg Globalnej skali oceny zaproponowany w 2002 roku przez FDA.

Badacz zbierze z dostępnej dokumentacji klinicznej wyjściowe wartości glikemii, insuliny, trójglicerydów, cholesterolu przed rozpoczęciem leczenia. Ponadto zebrane zostaną informacje na obrazie USG w zakresie objętości jajników i pęcherzyków antralnych.

Próbka 2-3 ml podstawowej krwi zostanie pobrana do oceny metabolomicznej przy użyciu czerwonej probówki do pobierania krwi BD vacutainer (Becton Dickinson, Oxfordshire, UK) (bez dodatków). Po odwirowaniu próbka natychmiast zamarznie do -80°C do czasu analizy.

Następnie pacjent zostanie poproszony o kontynuację leczenia mio-inozytolem (1,75 g), D-chiro-inozytolem (0,25 g) i glukomannanem (4 g) oraz o stawienie się na kontrolę po 90 dniach (V1).

4.2 Wizyta kontrolna 90 dzień (±15) po przyjęciu (V1) Podczas V1 pacjentka zostanie przesłuchana na temat regularnego leczenia i objawów klinicznych, ewentualnych zdarzeń niepożądanych oraz przebiegu cyklu miesiączkowego.

Ponadto wszyscy pacjenci zostaną poddani ponownej ocenie pod kątem parametrów antropometrycznych, biochemicznych i ultrasonograficznych.

W V1 zostanie pobrana druga próbka krwi 2-3 ml tymi samymi metodami, które opisano powyżej.

4.3 Analiza próbek biochemicznych i metabolomicznych Stężenie glukozy, insuliny, triglicerydów i cholesterolu we krwi ocenia się dla osób kontrolnych oraz dla przypadków na początku leczenia i po 3 miesiącach leczenia. Obliczono również HOMA-IR si. Objętość jajników i liczbę pęcherzyków antralnych oceniano za pomocą ultrasonografii dopochwowej wykonywanej przez przeszkolonego ginekologa.

Ekstrakcję, oczyszczanie i derywatyzację metabolomu przeprowadza się za pomocą zestawu MetaboPrep GC (Theoreo srl, Montecorvino Pugliano [SA], Włochy) zgodnie z instrukcjami producenta. Szczegóły dotyczące ekstrakcji metabolitów i ogólnego schematu analitycznego, w tym analiz próbek QA/QC, podano w Troisi i in. (2017, 2018)

Zarządzanie danymi i analiza statystyczna Pod koniec leczenia planowane jest zebranie danych wszystkich pacjentów i wprowadzenie ich w postaci zakodowanej lub przejrzystej do bazy danych (Excel dla Windows) o odpowiedniej strukturze, aby zawierała wszystkie oczekiwane pozycje. W celu zachowania zgodności z prawem dotyczącym prywatności wrażliwe dane nominalne zostaną odpowiednio zastąpione kodami numerycznymi przypisanymi do każdego pacjenta, tak aby z prostego przeglądania danych nie można było wywnioskować żadnego indywidualnego bezpośredniego odniesienia. Ponadto jedyne dane, które można wyodrębnić z bazy danych, dotyczą zagregowanych zbiorów przeznaczonych do publikacji do celów naukowych.

Dane są przedstawiane jako średnia ± odchylenie standardowe dla zmiennych ciągłych i liczbowe (procentowe) dla zmiennych kategorycznych.

Analizę statystyczną przeprowadza się przy użyciu oprogramowania Statistica (StatSoft, Oklahoma, USA) i Minitab (Minitab Inc, Pensylwania, USA). Normalny rozkład danych weryfikuje się za pomocą testu Shapiro-Wilksa. Ponieważ dane mają rozkład normalny, badacze stosują jednokierunkową ANOVA z testem post hoc Tukeya do porównań międzygrupowych. Wartość alfa (ɑ) jest ustawiona na 0,05. Test chi-kwadrat Pearsona służy do określenia różnic między grupami dla zmiennych kategorialnych.

W przypadku wielowymiarowej analizy danych dane chromatograficzne są zestawione w tabeli z jedną próbką na rząd i jedną zmienną (metabolit) na kolumnę. Wstępna obróbka danych polega na normalizacji każdego obszaru piku metabolitu do obszaru standardu wewnętrznego, a następnie uogólnionej transformacji logarytmicznej i skalowaniu danych przez autoskalowanie (wyśrodkowane na środku i podzielone przez odchylenie standardowe każdej zmiennej). PLS-DA przeprowadza się przy użyciu pakietu oprogramowania statystycznego R (Foundation for Statistical Computing, Wiedeń, Austria). Separację klas uzyskuje się za pomocą PLS-DA, która jest metodą nadzorowaną, która wykorzystuje techniki regresji wielowymiarowej w celu wyodrębnienia, za pomocą liniowych kombinacji oryginalnych zmiennych (X), informacji, które mogą przewidywać przynależność do klasy (Y). Regresję PLS przeprowadza się za pomocą funkcji plsr zawartej w pakiecie R pls. Klasyfikacja i walidacja krzyżowa są przeprowadzane przy użyciu odpowiedniej funkcji opakowującej zawartej w pakiecie karetki. Test permutacji jest przeprowadzany w celu oceny znaczenia dyskryminacji klasowej. W każdej permutacji budowany jest model PLS-DA między danymi (X) a permutowanymi etykietami klas (Y) przy użyciu optymalnej liczby komponentów określonej przez walidację krzyżową dla modelu w oparciu o oryginalne przypisanie klas. Wyniki zmiennej ważności w projekcji (VIP) są obliczane dla każdego metabolitu. Wynik VIP jest ważoną sumą kwadratów ładunków PLS, biorąc pod uwagę wielkość wyjaśnionej zmienności Y w każdym wymiarze. Metabolity VIP o najwyższej punktacji są porównywane pod względem zmian krotności (FC). FC to stosunek średnich obfitości między dowolnymi dwiema klasami i jest miarą opisującą, jak bardzo zmienia się wielkość, przechodząc od wartości początkowej do końcowej.

Szlaki metaboliczne są konstruowane przy użyciu aplikacji MetScape oprogramowania Cytoscape.