Composición arterial y resultado cardiovascular en la DIABETES (ACCODIS)

descripción del proyecto de doctorado

La pared arterial en pacientes con diabetes: ¿los cambios en las proteínas de la membrana basal arterial predicen una futura enfermedad arterial? ¿Se alteran los procesos de remodelación?

Solicitante: Anne-Sofie Faarvang Thorsen1, MD

Supervisor principal: Profesor Lars Melholt Rasmussen1

Co-supervisores: Asoc. Profesor Michael Hecht Olsen2

Asoc. Profesor Martín Overgaard1

Colaboradores: Director Morten Karsdal, Nordic Bioscience3

Consultor Lars Peter Riber4

Profesor Peter Nilsson5

1: Departamento de Bioquímica Clínica y Farmacología, Hospital Universitario de Odense. 2: Departamento de Medicina Interna, Hospital Holbaek, Universidad del Sur de Dinamarca. 3: Nordic Biosciences 4: Departamento de Cirugía Cardiaca, Vascular y Torácica, Hospital Universitario de Odense 5: Malmö Diet and Cancer Study, Malmö, Suecia

Descripción del proyecto Las enfermedades cardiovasculares (ECV) ocurren con frecuencia entre las personas con diabetes mellitus tipo 2 (DM2), y la mortalidad después de intervenciones cardíacas y eventos cardiovasculares aumenta significativamente en la DM2. Recientemente hemos identificado una serie de alteraciones moleculares distintas en partes no ateroscleróticas del árbol arterial en la diabetes, que representan elementos de la patología vascular diabética generalizada. No se sabe si estas alteraciones diabéticas generalizadas están relacionadas con el desarrollo de enfermedades cardiovasculares clínicas.

Hipótesis general Nuestra hipótesis general es que las alteraciones específicas de las proteínas arteriales, particularmente relacionadas con las moléculas de la membrana basal como se observa en la DM2, son seguidas por una remodelación disfuncional de los vasos (hacia adentro en lugar de hacia afuera). Dichos cambios pueden proporcionar los antecedentes para la reducción de la luz en relación con la acumulación de aterosclerosis en la diabetes y explicar la alta incidencia de enfermedades cardiovasculares entre estos pacientes.

Objetivos y diseños de estudio

En este proyecto de doctorado, probaremos dos aspectos de esta hipótesis con los siguientes objetivos:

1. Determinaremos si la presencia de un patrón de proteína arterial diabética predice la incidencia futura de eventos cardiovasculares y la aparición de reducción de la luz y, en última instancia, oclusión en el vaso de reparación (arteria mamaria interna izquierda (LIMA)) después de las operaciones de derivación.

   Cuantificaremos proteínas específicas de la membrana basal arterial mediante análisis de proteoma dirigido en tejido arterial humano no aterosclerótico (la arteria de reparación de las operaciones de derivación coronaria) y en plasma mediante inmunoensayos de un gran grupo de pacientes con derivación coronaria con o sin DM2. Determinaremos si la concentración de estos componentes en un estudio de seguimiento predice la oclusión (proxy clínico para la reducción de la luz) del propio vaso reparado, la incidencia de eventos cardiovasculares y/o el desarrollo de enfermedad diabética de vasos pequeños y grandes.

2. Determinaremos si se produce remodelado arterial disfuncional en DM2 o sujetos con alteración de la glucemia en ayunas en relación con la acumulación de placa en la arteria carótida. Por tanto, identificaremos la influencia de la DM2 en la relación entre las cantidades de aterosclerosis, remodelado (tamaño luminal y pared espesor) y la presión arterial en individuos previamente escaneados del Malmö Diet and Cancer Study.

Perspectiva Los resultados proporcionarán información importante sobre si los cambios de la matriz arterial en la diabetes están implicados en el desarrollo de los síntomas cardiovasculares y, además, determinarán si se produce una remodelación disfuncional en la diabetes.

Tal conocimiento fisiopatológico es un requisito previo para:

• mejores biomarcadores para diagnosticar y estratificar pacientes con DM2 con riesgo de enfermedad arterial
• desarrollo de nuevos objetivos para el tratamiento de las complicaciones de los grandes vasos en la diabetes

Antecedentes La DM2 es una enfermedad grave que resulta en la afección de varios sistemas de órganos, incluido el sistema cardiovascular (1). La diabetes es una amenaza global que afecta a todas las partes del mundo. El número de personas que padecen DM2 está aumentando y se espera que aumente a más de 350 millones de personas en todo el mundo en el año 2030 (2). Los pacientes con DM2 tienen un mayor riesgo de morbilidad y mortalidad por ECV como accidente cerebrovascular e infarto agudo de miocardio (IAM) y tienen una esperanza de vida más corta (3, 4). La diabetes también aumenta el riesgo de complicaciones microvasculares como la retinopatía diabética (5).

El tejido arterial se ve afectado por la diabetes. La patología arterial incluye cambios en la matriz extracelular, aumento de la rigidez arterial, remodelado disfuncional (6), disfunción endotelial y aterosclerosis acelerada. Se plantea la hipótesis de que la rigidez arterial en pacientes diabéticos con hipertensión se correlaciona con la disfunción endotelial (7). Los pacientes con DM2 que se someten a una cirugía de injerto de bypass de arteria coronaria (CABG) tienen un mayor riesgo de muerte en comparación con los pacientes no diabéticos, como se muestra en el estudio sueco SWEDEHEART (8). La diabetes afecta la supervivencia a largo plazo después de la CABG, y si el paciente tiene enfermedad renal diabética u otras complicaciones vasculares diabéticas, la diferencia es aún más profunda (9). Los mecanismos exactos que vinculan la DM2 con las ECV no se conocen por completo. Durante los últimos años hemos identificado cambios moleculares en la pared arterial en humanos con DM2. Usando técnicas de micromatrices para el análisis de ARN, encontramos que las vías moleculares específicas estaban alteradas en el tejido arterial en la diabetes. Estas vías desreguladas incluían la señalización de insulina y la biosíntesis de matriz (10). También observamos que una molécula relacionada con la membrana basal y la elastina llamada fibulina-1 está presente en mayores cantidades en la diabetes (11-13). Posteriormente, hemos podido demostrar que el aumento de las cantidades de fibulina-1 en el plasma se correlaciona con morbilidades cardiovasculares y predice la mortalidad (11, 13, 14). Recientemente, hemos utilizado el análisis del proteoma de arterias humanas para encontrar proteínas arteriales con diferentes concentraciones en arterias diabéticas (15).

Observamos que la mayoría de las proteínas de la membrana basal y ciertas proteínas relacionadas con los estados fenotípicos del músculo liso, en combinación con otros péptidos, están presentes en concentraciones alteradas en la diabetes.

Como se mencionó anteriormente, solo entendemos algunos de los procesos que vinculan la diabetes con el desarrollo de ECV. Todavía tenemos que determinar si los hallazgos mencionados anteriormente están realmente involucrados en el desarrollo de ECV clínicas.

La hipótesis general de este proyecto de doctorado se representa en la figura 1 anterior: Los factores metabólicos y hormonales conducen a cambios difusos en la membrana basal arterial en el árbol arterial. Esto conduce a una capacidad alterada de la pared arterial para adaptarse mediante remodelación externa como consecuencia normal de la aterosclerosis. Por el contrario, se produce una contracción hacia el interior que conduce a la obstrucción del lumen. Por lo tanto, los cambios generalizados de la matriz arterial diabética pueden conducir en última instancia a obstrucciones de la luz arterial y síntomas clínicos que acoplan cambios moleculares con el desarrollo de ECV.

Los pacientes con DM2 tienen niveles séricos elevados de fibulina-1, expresión elevada de elementos de la lámina basal en la arteria mamaria interna izquierda y aumento de la glucosilación del colágeno en la pared arterial debido a la hiperglucemia (13). Todo esto puede contribuir al aumento de la rigidez arterial central observado en la DM2, que puede evaluarse mediante la velocidad de la onda del pulso femoral carotídeo (cfPWV). El envejecimiento normal, así como la hipertensión, en las arterias carótidas, se asocia con una remodelación hipertrófica con aumento tanto del diámetro de la luz como del grosor de la pared, evaluado por el grosor íntima-media (GIM). Recientemente hemos demostrado que la progresión del GIM se asocia con la suma de factores de riesgo cardiovascular pero con diferentes contribuciones de los factores de riesgo individuales en la arteria carótida común (ACC) y la bifurcación, respectivamente. Sin embargo, el IMT por sí solo podría no reflejar completamente la remodelación de la arteria carótida, porque la luz puede cambiar de manera diferente en comparación con el IMT en respuesta a ciertos factores de riesgo cardiovascular. La progresión del GIM se asocia positivamente con la mayoría de los factores de riesgo cardiovascular, mientras que el aumento de la luz se asocia principalmente con el envejecimiento y la hipertensión (16). Además, se ha demostrado que la aterosclerosis coronaria conduce a una remodelación hacia adentro en lugar de hacia afuera en la DM2, lo que podría ser secundario a la rigidez de las arterias y explicar el resultado inverso después de la intervención coronaria percutánea (ICP) en la DM2.

El estudio de doctorado constará de dos subestudios independientes, como se describe a continuación.

Estudio 1

Hipótesis Nuestra hipótesis es que la cantidad de proteínas de la membrana basal en el tejido arterial y el plasma de pacientes con DM2 puede predecir el resultado clínico a largo plazo.

Pacientes y métodos De la mayoría de las operaciones de by-pass coronario realizadas en OUH durante los últimos 8 años, hemos asegurado el manejo y almacenamiento inmediato de la arteria reparada (arteria mamaria interna). La porción media de cada arteria se libera del tejido circundante, se corta, se fija con formol a corto plazo y se incluye en parafina. El resto del tejido se congela. El tejido se almacena en el "biobanco de la arteria de Odense", donde se han recolectado continuamente muestras de tejido y sangre de pacientes sometidos a CABG desde 2008. Incluiremos a todos los pacientes con tejido disponible en nuestro biobanco, que serán aproximadamente 180 pacientes con DM2 y 420 pacientes sin diabetes.

Consideraciones éticas Todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito y el estudio fue aprobado por los comités de ética locales (S-20100044). Los estudios clínicos serán aprobados por el Comité Ético Científico Regional para el Sur de Dinamarca y todos los proyectos serán informados a la Agencia Danesa de Protección de Datos.

Análisis de proteoma dirigido en tejido arterial El análisis de proteoma dirigido cuantitativo basado en espectrometría de masas se realizará en pequeñas cantidades de tejido arterial utilizando modificaciones de nuestros protocolos desarrollados recientemente. Se utilizarán cuatro secciones de tejido incrustado en parafina de cada paciente y se realizará un análisis de proteoma específico según los métodos basados ​​tanto en el análisis de proteoma de la pared arterial (15, 17, 18) como en el análisis LC-MS múltiple y específico de diferentes proteínas en otros estudios (19, 20). Nuestro análisis de proteoma se basa en material de cortes del mismo tejido fijado en formalina e incluido en parafina (FFPE) que se usa para histología. Cuantificaremos péptidos derivados de proteínas abundantes, donde previamente encontramos cambios en la diabetes, es decir, colágeno tipo IV cadena alfa 1 y alfa 2, nidogen, biglycan, laminina y desmina y, además, utilizaremos la cantidad de alfa-actina del músculo liso y vimentina. como controles, ya que no se observaron alteraciones previamente en pacientes con DM2.

A partir de estos resultados calcularemos una "puntuación de riesgo de la membrana basal" compuesta. Esta puntuación se basa en que cada proteína de la membrana basal vale 0 si la concentración está por debajo de la mediana y 1 si la concentración está por encima. La puntuación combinada de la membrana basal se calcula como la suma de cada una de las cinco proteínas, es decir, puede tener valores entre 0 y 5.

Cálculos histomorfométricos cuantitativos Cuantificaremos el volumen de tejido de fibrosis, el contenido de elastina, el contenido de células lisas y el número como se describió previamente Preil et al (15).

Mediciones plasmáticas de proteínas de la membrana basal Planeamos medir las cantidades de fragmentos circulantes de varias de las mismas proteínas mencionadas anteriormente, es decir, colágeno tipo IV (C4M3a, C4M), biglicano (BGN) y laminina, así como fibulina-1. Estos ensayos han sido desarrollados por Nordic Biosciences. Los datos piloto sobre un pequeño grupo de nuestros pacientes diabéticos y no diabéticos combinados (n=36) muestran que el nivel plasmático de estos componentes se correlaciona bien con la HbA1c (C4M3a: r=0,39, p<0,05, C4M2: r=0,36, p<0,05, BGN: r=0,45, p<0,01, Signe Holm Nielsen et al, Nordic Bioscience, inédito).

Mediciones de resultados

Investigaremos las posibles asociaciones entre las concentraciones plasmáticas y tisulares de las proteínas específicas y varios parámetros clínicos registrados en un período de seguimiento de 2 a 8 años después de la recolección de tejido arterial. Los parámetros de seguimiento incluirán los siguientes tres tipos:

1. Parámetros relacionados con el buque de reparación, es decir, Tamaño de la luz LIMA en la última arteriografía coronaria realizada después de la operación en comparación con el tamaño de la luz LIMA en la operación
2. Parámetros relacionados con el corazón, es decir, IM, angina, re-CAD, insuficiencia cardiaca
3. Parámetros relacionados con la ocurrencia de eventos cardiovasculares generalizados y complicaciones diabéticas en el grupo de diabéticos.

Disponemos de una subfracción de los pacientes operados con coronariografía renovada (aproximadamente el 35 %). Somos conscientes de que este subgrupo está sesgado debido a las indicaciones clínicas para la arteriografía renovada que dan razones contrapuestas para una luz LIMA más pequeña en la arteriografía renovada. Mediremos el tamaño del lumen de esta arteria mamaria interna a partir de la arteriografía coronaria y lo compararemos con el tamaño del vaso en el momento de la extracción en la operación, donde se puede medir por histología. Aunque es posible que los dos métodos no estén calibrados por igual, suponemos que el sesgo es aproximadamente el mismo en todos los pacientes. En este subgrupo mediremos las correlaciones entre el cambio del diámetro de la luz (u oclusión) y las medidas plasmáticas y arteriales de las proteínas seleccionadas.

Se registran los siguientes parámetros de seguimiento clínico: mortalidad por todas las causas, infarto de miocardio no mortal, revascularización coronaria, parada cardiaca con reanimación, hospitalización por insuficiencia cardiaca o angina de pecho inestable, ictus no mortal, progresión de nefropatía o retinopatía. La progresión de la nefropatía se define como insuficiencia renal (definida por la necesidad de diálisis crónica), desarrollo de macroalbuminuria o duplicación de la s-creatinina (solo por encima de 200 uM). El desarrollo de retinopatía se define como retinopatía proliferativa o edema macular que requiere terapia con láser, vitrectomía o ceguera relacionada con diabetes (agudeza visual de Snellen por debajo de 0,1). La muerte se obtiene del Sistema de Registro Civil. Los códigos de procedimientos, operaciones y diagnósticos individuales se obtienen del registro nacional danés de pacientes. La relación P-creatinina y U-albúmina-creatinina se obtiene a través de la base de datos de resultados de laboratorio. Nuestro punto final primario se define como un compuesto de eventos cardíacos (IM, revascularización coronaria, muerte súbita, hospitalización por insuficiencia cardíaca o angina de pecho). Se espera que la tasa de eventos sea del 2 % anual (ref), es decir, aproximadamente 60 eventos de todos nuestros 600 pacientes después del tiempo promedio de seguimiento de 5 años.

Además, investigaremos las asociaciones entre los niveles plasmáticos y tisulares arteriales de los componentes medidos. También juzgaremos si las proteínas específicas están relacionadas con la prevalencia y la incidencia de la enfermedad microvascular diabética como se definió anteriormente (es decir, albuminuria, insuficiencia renal, retinopatía).

Los datos clínicos relacionados con el inicio de la diabetes, la medicación, los datos bioquímicos desde el momento de la operación y las comorbilidades se almacenan en nuestra base de datos en el momento de la operación.

Plan de análisis

1. Probar si la "puntuación de riesgo de la proteína de la membrana basal" está asociada negativamente con

   1. Tamaño del lumen de la arteriografía coronaria realizada en relación con la operación
   2. La relación entre el tamaño de la luz de la coronariografía renovada y la realizada en relación con la operación mediante análisis de regresión univariante y multivariante
2. Pruebe si la "puntuación de riesgo de proteínas de la membrana basal" predice el criterio de valoración cardíaco compuesto (IM, revascularización coronaria, muerte súbita, hospitalización por insuficiencia cardíaca o angina de pecho) utilizando análisis de regresión de Cox univariados y multivariados (punto final primario).
3. Pruebe si la "Puntuación de riesgo de proteínas de la membrana basal" predice el criterio de valoración compuesto amplio de mortalidad por todas las causas, eventos cardiovasculares importantes, progresión de la nefropatía o retinopatía utilizando análisis de regresión de Cox univariados y multivariados

Análisis estadístico, bioinformática, estimación de potencia y consideraciones sobre el tamaño de la muestra. Los datos se analizarán mediante análisis de correlación simple, pero también mediante modelos de riesgo proporcional con ajustes para el tiempo de seguimiento y parámetros clínicos relevantes. Se utilizarán la prueba exacta de Fisher y la prueba de chi-cuadrado para evaluar las tasas de eventos en grupos de pacientes con cantidades altas o bajas de proteínas específicas. El método de Benjamini-Hochberg se utilizará para corregir pruebas múltiples, cuando sea adecuado. Los análisis se realizarán principalmente en el grupo total de individuos (n = 600) analizando las interacciones por presencia de DM2, pero también se realizarán análisis de subgrupos en pacientes diabéticos y no diabéticos.

El cálculo del tamaño de la muestra para el punto final primario (compuesto de eventos cardíacos) se calcula de la siguiente manera: Suponemos que el número y la proporción de eventos serán: BM-score 0: n=50, eventos: 2 %, BM-score 1: n=100, eventos: 6 %, BM-score 2: n=150, eventos: 8 %, BM-score 3: n=150, eventos: 10 %, BM-score: n=100, eventos: 15 %, BM-score 5: n=50, eventos: 22 %. El cálculo del número necesario de individuos necesita encontrar una diferencia estadística entre el grupo de puntaje 0 y el grupo de puntaje 5 es 50 en cada grupo.

Viabilidad y organización del proyecto El proyecto se lleva a cabo en el Centro de Medicina Individualizada en Enfermedades Arteriales (CIMA), el Centro de Proteómica Clínica y el Departamento de Bioquímica Clínica y Farmacología del Hospital Universitario de Odense. Todos los instrumentos y conocimientos están disponibles. Se han desarrollado métodos para el análisis del proteoma del tejido arterial.

Impacto previsto de los resultados y perspectiva Menos de diez artículos anteriores, en todo el mundo, informaron sobre el uso del análisis de proteoma en tejido arterial humano, la mayoría de ellos con el uso de material de menos de 10 personas. Estudios previos han demostrado que los signos histológicos de remodelado disfuncional (hipertrofia) en los vasos pequeños predicen muy bien los eventos cardiovasculares (21). Sin embargo, no se sabe nada acerca de los aspectos estructurales y moleculares de las arterias más grandes.

Los resultados del estudio propuesto pueden señalar si las cantidades de proteínas arteriales, que se sabe que están alteradas en la DM2, están asociadas con el desarrollo de eventos cardiovasculares. Por lo tanto, generaremos nuevos conocimientos sobre importantes vías moleculares, que pueden estar involucradas causalmente en el desarrollo de enfermedades arteriales. La identificación de tales proteínas es importante para encontrar nuevas modalidades de tratamiento y biomarcadores para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares.

Esperamos poder demostrar que las alteraciones cuantitativas de proteínas específicas y grupos de proteínas en la vasculatura y en el plasma predicen el desarrollo de diferentes resultados de ECV. Tales hallazgos apoyarán fuertemente la hipótesis general de que las alteraciones arteriales generales en la diabetes son importantes para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares.

Estudio 2

Hipótesis Nuestra hipótesis es que los pacientes con DM2 tienen una remodelación carotídea disfuncional con una mayor remodelación hacia adentro y una disminución del diámetro de la luz. El objetivo general es investigar la importancia relativa de los diferentes factores de riesgo cardiovascular para la remodelación de la arteria carótida evaluada por la luz carotídea, el IMT y el área transversal (CA) en la CCA y la bifurcación, respectivamente.

Las hipótesis específicas son:

1. La bifurcación vs CCA presentará más remodelación hacia adentro ya que es más propensa a la aterosclerosis
2. La intolerancia a la glucosa y, en mayor medida, la DM2 se asocian con un mayor grado de remodelación interna
3. Este mayor grado de remodelación hacia adentro se asocia con una mayor rigidez arterial evaluada por cfPWV y cambios en la lámina basal evaluados por marcadores seleccionados

Pacientes y métodos Este estudio es un subestudio del gran Malmö Diet and Cancer Study en el que se realizó una ecografía de la arteria carótida en 3426 hombres y mujeres suecos de mediana edad en 1991-1994 (línea de base) y nuevamente en 2007-12 (reexamen) .

Consideraciones sobre análisis estadístico, bioinformática, estimación de potencia y tamaño de muestra En análisis de regresión múltiple probaremos la asociación entre

1. Factores de riesgo CV e IMT, lumen, CA y distensibilidad en CCA y la bifurcación al inicio
2. Factores de riesgo CV e IMT, lumen, CA y distensibilidad en CCA y la bifurcación en la reexploración
3. Cambios en los factores de riesgo CV y ​​cambios en IMT, lumen, CA y distensibilidad en CCA y la bifurcación entre la línea de base y el reexamen
4. Niveles séricos de marcadores seleccionados de cambios en la lámina basal y factores de riesgo CV, cfPWV así como IMT, lumen, CA y distensibilidad en CCA y la bifurcación en el nuevo examen
5. Realice pruebas de género, glucosa en ayunas, DM2, distensibilidad CCA, cfPWV y marcadores seleccionados de cambios en la interacción de la lámina basal con las asociaciones anteriores.

Viabilidad y organización del proyecto Este proyecto se llevará a cabo en el Centro de Medicina Individualizada en Enfermedades Arteriales (CIMA), Centro de Proteómica Clínica y el Departamento de Bioquímica Clínica y Farmacología del Hospital Universitario de Odense, Odense, Dinamarca. Todos los instrumentos están disponibles y la experiencia es accesible.

Impacto anticipado de los resultados y perspectiva Los resultados del estudio 2 pueden generar nuevos conocimientos y una comprensión más profunda de cómo la DM2 afecta la arteria carótida, el grado de remodelación interna y la reducción de la luz. Esto podría cambiar la forma en que tratamos a los pacientes diabéticos con aterosclerosis carotídea, ya que estos pacientes tienen un alto riesgo de desarrollar estenosis total de la arteria carótida. El conocimiento de la patogenia subyacente es la clave para una intervención más temprana y la reducción del riesgo para el paciente.

Con respecto a ambos estudios 1 y 2

Realización práctica de los estudios 1 y 2 El solicitante participará en el análisis del proteoma y el análisis histomorfométrico del tejido. Toda la experiencia y el equipo están disponibles en el Departamento de Bioquímica Clínica y Farmacología del Hospital Universitario de Odense. El análisis de datos será realizado por el solicitante y las publicaciones serán escritas principalmente por el solicitante como primer autor. El solicitante medirá la luz de las arterias carótidas comunes y del bulbo carotídeo utilizando grabaciones de bucle de cine almacenadas.

Publicaciones esperadas en el estudio 1 y 2

1. Cambios en las proteínas de la matriz arterial y plasmática en relación con el desarrollo de diámetros LIMA después de CABG (Autores: Thorsen, AF, Overgaard, M, Nordic Bioscience, Olsen, MH, Rasmussen, LM)
2. Cambios en las proteínas de la matriz arterial y plasmática en relación con la mortalidad cardiovascular, análisis del proteoma en relación con el resultado después de la CABG (Autores: Thorsen, AF, Nordic Bioscience, Olsen, MH, Overgaard, M, Rasmussen, LM)
3. El impacto de la intolerancia a la glucosa y la diabetes manifiesta en el endurecimiento arterial, las placas ateroscleróticas y la remodelación de la arteria carótida (Autores: Thorsen, AF, Malmø-researchers, Rasmussen, LM, Olsen, MH) Estas sugerencias pueden estar sujetas a cambios dependiendo del desarrollo de la investigaciones

Horario

Junio ​​de 2018 Iniciar análisis de proteoma en estudio 1 de noviembre de 2018 Iniciar análisis de datos en estudio 2 de junio de 2019 Estudio completo 2 de diciembre de 2019 Análisis de proteoma completo en estudio 1 de diciembre de 2019 Comenzar análisis de datos en estudio 1 de diciembre de 2020 Estudio completo 1 de enero-junio de 2021 Estudio de doctorado completo

Referencias

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