„Mechanizmy i biomarkery odpowiedzi i oporności na obecne terapie celowane w raku żołądka” (THERRES) (THERRES)

Projekt badania jest prospektywny i obejmie pacjentów z guzami żołądka skierowanych do Kliniki Gastroenterologii Uniwersytetu Medycyny i Farmacji w Krajowej w celu oceny miejscowego stopnia zaawansowania EUS włączonych w ciągu 18 miesięcy.

Dane zbierane dla każdego uczestnika będą obejmować: Dane osobowe (imię, nazwisko, wiek, płeć); wyniki wcześniejszych badań (morfologia krwi, testy czynnościowe wątroby i nerek, markery nowotworowe, gastroskopia, tomografia komputerowa), zmienne EUS (w tym CEH-EUS), wyniki histologiczne i immunohistochemiczne, status TNM i pTNM (jeśli to możliwe), wyniki analizy molekularnej.

Badania obrazowe Wszyscy pacjenci zostaną poddani badaniu EUS i CEH-EUS przy użyciu radialnych narzędzi EUS. Przed badaniem żołądek musi być pusty przez co najmniej 8 godzin. Podczas badania zostaną pobrane biopsje z tkanki prawidłowej i nowotworowej w celu analizy ekspresji genów. Do badania EUS pacjentka zostanie ułożona na lewym boku. Zakres EUS zostanie wprowadzony pod bezpośrednim widzeniem, przejdzie przez guz, a badanie powinno rozpocząć się podczas wycofywania przy częstotliwości 7,5 MHz. Guz zostanie scharakteryzowany, opisując jego echogeniczność, echostrukturę, rozmiar, zasięg do ściany i otaczających struktur, a także zostanie oceniony za pomocą modyfikacji klasyfikacji TNM. Zostanie odnotowana obecność/nieobecność sygnałów power Dopplera. Wszystkie węzły chłonne zostaną zgłoszone wraz z ich maksymalnym rozmiarem, echogenicznością, kształtem i marginesami. Węzły o średnicy większej niż 5 mm, o hipoechogenicznym wyglądzie, okrągłym kształcie (a nie jajowatym lub płaskim), ostro odgraniczonych granicach i zlokalizowane w pobliżu guza będą podejrzane o złośliwość.

Procedura CEH-EUS: zostanie użyty dwupanelowy obraz z typowym konwencjonalnym obrazem EUS w trybie B w skali szarości po prawej stronie i kontrastowym obrazem harmonicznym po lewej stronie, zgodnie z wcześniej ustalonymi ustawieniami. Badanie zostanie przeprowadzone przy niskim wskaźniku mechanicznym (tryb obrazowania harmonicznego z dynamicznym szerokopasmowym kontrastem) wynoszącym 0,2. Punktem startowym timera będzie moment podania dożylnego środka kontrastowego (SonoVue 2,4 mL), z całym filmem (T0-T120s) nagranym na wbudowanym HDD systemu ultrasonograficznego do późniejszej analizy. Parametry do obiektywnego pomiaru perfuzji guza będą obejmować maksymalną intensywność wzmocnienia, średni czas przejścia, czas do szczytu (czas wymywania), nachylenie wymywania, pole pod krzywą, reprezentujące pośrednio przepływ krwi lub objętość krwi u pacjentów z GC.

Podczas EUS mogą wystąpić powikłania, ale są one rzadkie. Obejmują one krwawienie w miejscu biopsji, które jest zwykle minimalne, samoograniczające się i rzadko wymaga obserwacji. Perforacja żołądka jest niezwykle rzadka. Profil bezpieczeństwa ultrasonograficznego środka kontrastowego (Sonovue®) wykazał bardzo niską częstość występowania działań niepożądanych. Nie jest nefrotoksyczny, a częstość występowania nadwrażliwości lub ciężkich reakcji alergicznych jest mniejsza niż w przypadku obecnych środków rentgenowskich i porównywalna z częstością innych środków kontrastowych do rezonansu magnetycznego. Sono-Vue jest dopuszczony do użytku klinicznego w krajach UE.

Materiał biologiczny pobrany podczas badania zostanie zamrożony i przechowywany. Obejmuje to jeden ml pełnej krwi i 4 biopsje tkanek (2 z prawidłowej tkanki i 2 z guza) o grubości od 2 do 3 mm każda. Po osiągnięciu oczekiwanej liczby uczestników próbki zostaną poddane badaniom molekularnym w celu oceny markerów angiogenezy, jak wyszczególniono w dalszej części protokołu. Materiały biologiczne będą przechowywane i analizowane przez szacowany czas 20 miesięcy od rozpoczęcia badania. Próbki biopsji do immunohistochemii zostaną umieszczone w roztworze formaliny i wysłane do laboratorium patologii.

Testy molekularne

• Analiza krwi. Krew pełna (1 ml) zostanie pobrana przed procedurami obrazowania w probówce Eppendorfa na roztworze EDTA, umieszczona natychmiast w temperaturze 40°C na maksymalnie 24 godziny, a następnie przechowywana w temperaturze -80°C do późniejszej analizy czynników angiogennych.
• Próbki biopsji tkanki normalnej i GC. Ekspresja genów będzie analizowana przy użyciu qPCR z sondami znakowanymi Taqman®. Do ilościowego określenia wyników uzyskanych metodą RT-PCR w czasie rzeczywistym zostanie zastosowana metoda krzywej standardowej. Sparowane próbki zostaną pobrane w RNAlater (Ambion), przechowywane w temperaturze 40°C przez 12-24 godziny, a następnie przechowywane w temperaturze -80°C. Późniejsza analiza oceni ekspresję genów markerów angiogennych.

Immunohistochemia IHC będzie dotyczyła markerów angiogennych: rodziny VEGF-A i ich receptorów: VEGFR oraz receptorów kinaz tyrozynowych (RTK).

Ekspresja VEGF-C w próbkach guza (marker limfangiogenezy) zostanie określona ilościowo. Ponadto zostanie ustalona korelacja między wynikami EUS (stadium N) a ekspresją VEGF-C.

Gęstość mikronaczyń (MVD) zostanie obliczona przy użyciu immunohistochemii dla CD105.

Analiza statystyczna Szacunkowa liczba uczestników włączonych do badania to co najmniej 50 w ciągu pierwszych 24 miesięcy. Przeprowadzona zostanie zarówno opisowa analiza danych, jak i wnioskowanie statystyczne.

Korelacje między parametrami CE-EUS a wynikami patologicznymi i genetycznymi zostaną przeanalizowane za pomocą testu T i współczynnika korelacji Pearsona (r) dla danych ciągłych, podczas gdy test Chi-kwadrat zostanie zastosowany dla danych kategorycznych. Jednokierunkowa analiza wariancji (ANOVA) zostanie przeprowadzona w celu porównania różnych podgrup (etapów T). Analiza przeżycia od momentu rozpoznania zostanie oceniona za pomocą krzywych Kaplana-Meyera. Przeanalizowane zostaną parametry tradycyjne, takie jak stopień zaawansowania TNM, rodzaj leczenia. Istotność statystyczna zostanie zdefiniowana jako wartość p mniejsza niż 0,05.

Potencjalne implikacje dla przyszłej opieki nad pacjentem przeważą nad tym minimalnym ryzykiem.

Osoby badane otrzymają pisemną i ustną zgodę przed włączeniem do badania. Wywiad obejmie szczegółowe informacje, w tym zrozumiałą prezentację projektu z jego przewidywalnymi zagrożeniami i skutkami ubocznymi, oczekiwanymi wynikami i korzyściami z badań.

Wszelkie nieplanowane zdarzenia lub działania niepożądane będą niezwłocznie zgłaszane do Regionalnej Komisji Etycznej ds. badań biomedycznych.