Autologní dendritická buněčná terapie pro supresi diabetu 1. typu: bezpečnostní studie

V této studii dobrovolníci s prokázaným diabetem 1. typu, který vyžaduje náhradu inzulinu, kteří nevykazují žádné komplikace související s diabetem nebo jinou klinickou patologii, nejprve podstoupí kompletní fyzikální, biochemické a imunologické vyšetření. Autologní dendritické buňky odvozené z monocytů budou získány po leukaferéze. Dendritické buňky budou ošetřeny ex vivo antisense oligonukleotidy a kryokonzervovány v alikvotech pro následné intradermální podání do míst nejblíže fyzickému umístění slinivky v těle. Fyziologické, biologické a imunologické odezvy na vakcínu proti dendritickým buňkám budou hodnoceny během období studie. První skupině dobrovolníků budou podány autologní dendritické buňky bez jakékoli ex vivo léčby (7/15) a druhé skupině bude podáván iDC (8/15). Pokud neexistují žádné důkazy o toxicitě nebo nežádoucích účincích spojených s vakcínou proti dendritickým buňkám a pouze po schválení FDA a IRB zahájíme novou studii srovnávající účinnost kontrolních DC a iDC při zlepšování glykémie a zvrácení autoimunity u pacientů s novým nástupem.

V současné době, kromě humanizované anti-CD3 protilátky se značnými vedlejšími účinky, neexistují žádné jiné prostředky pro zvrácení nově vzniklého diabetu 1. typu. Tyto studie budou vůbec první, kde se použije přenos autologních dendritických buněk k potlačení autoimunitního onemocnění a případně k jeho zvrácení v rané fázi klinického procesu.

Navrhujeme ověřit bezpečnost autologních dendritických buněk ošetřených ex vivo antisense oligonukleotidy zacílenými na primární transkripty kostimulačních molekul CD40, CD80 a CD86 (tyto buňky nazýváme „imunoregulační dendritické buňky; iDC) nejprve u dobrovolníků se zavedeným typem 1 cukrovka.

Osobnostní rysy a emoční stabilita byly spojeny s adherencí k léčbě u jiných lékařských populací (např. Christensen a kol., 2002; Dew a kol., 2001). Při dodržování tohoto protokolu (např. setrvání ve studii) u tohoto malého vzorku významně ovlivní výsledky a že samotná léčba může ovlivnit náladu, budeme hodnotit osobnostní rysy na začátku studie a sledovat náladu po celou dobu studie.

2.2 Význam studií: Neočekáváme žádné bezpečnostní problémy s tímto přístupem, ale musíme být opatrní na všech úrovních vzhledem k tomu, že se jedná o imunomodulační terapii. Přinejmenším budou získána data o tom, zda úspěch, který jsme pozorovali s iDC u NOD myší, lze případně upravit v jiných protokolech zaměřených na obnovení normoglykémie nebo zlepšení kontroly glykémie spolu se zvýšenou prevalencí domnělých imunoregulačních T buněk u nedávno diagnostikovaných lidé.

3.0 NÁVRH A METODY VÝZKUMU

3.1 Informace o léku/zařízení 3.1.1 Autologní dendritické buňky (kontrolní dendritické buňky): Jsou to buňky odvozené z produktu leukaferézy každého pacienta. Produkt leukaferézy se zpracovává v systému elutriace buněk Elutra/AastromTM (viz přiložené SOP # CPL-0158 a CPL-0166), aby se získaly nezralé dendritické buňky. Konečný autologní produkt po těchto postupech se nazývá kontrolní dendritické buňky.

3.1.2 Autologní imunoregulační, diabetes-supresivní dendritické buňky (iDC): Podali jsme žádost IND (připojená) FDA k pokrytí diabetes potlačujícího provedení kontrolních dendritických buněk, které nazýváme „imunoregulační dendritické buňky; iDC. IND pokrývá ošetření kontrolních dendritických buněk fosforothioátem modifikovanými oligonukleotidy zacílenými na primární transkripty kostimulačních molekul CD40, CD80 a CD86. Kontrolní DC a dendritické buňky ošetřené oligonukleotidem (iDC) jsou v tomto návrhu studijními buněčnými produkty.

3.1.3 Přístroj pro leukaferézu: Toto bude prováděno s buněčným kolektorem Fenwal CS3000 Plus nebo jeho ekvivalentem, za použití velkoprůsvitného katetru s dvojitým lumenem jako periferního žilního přístupu s celkovým zpracováním přibližně 10–12 litrů na relaci. Zařízení a jeho ekvivalenty jsou schváleny FDA pro zde uvedené postupy k získání purifikovaných leukocytů. Tyto procedury budou provádět pracovníci se zkušenostmi s leukaferézou, najatí z Centrální krevní banky v Pittsburghu.

3.1.4 Psychologická opatření: NEO-FFI je dotazník o 60 položkách na papíře a tužce založený na pětifaktorové teorii osobnosti (neuroticismus, extraverze, otevřenost, vstřícnost a svědomitost). Pro tuto studii budeme zkoumat škály Neurotismus a Svědomitost. Beck Depression Inventory, 2. vydání (BDI-2) a Beck Anxiety Inventory (BAI), každý obsahuje 21 papírových a tužkových dotazníků, které jsou široce používány v psychiatrické a lékařské populaci.

3.2 Návrh a metody výzkumu 3.2.1 Uspořádání/umístění studie Systémové, fyziologické a imunologické monitorování pacientů před, během léčebného cyklu a po léčbě bude probíhat na klinice CTRC Univerzitní nemocnice Montefiore UPMC Health System (MUH- CTRC) pod dohledem spoluřešitelů této studie a sester z CTRC. Subjekty podstoupí leukaferézu v ambulantním prostředí na MUH-CTRC nebo University of Pittsburgh Cancer Center (UPCI) nebo Central Blood Bank of Pittsburgh (v závislosti na nejvhodnějším místě pro každého pacienta); přijímat studované dendritické buňky v ambulantním prostředí na MUH-CTRC; a podstoupit zbývající testy a procedury v MUH-CTRC. Subjekty absolvují přibližně 16 návštěv na místech popsaných výše, přičemž každá návštěva bude trvat přibližně 2-4 hodiny v závislosti na tom, jaké procedury se při této konkrétní návštěvě provádějí. Všechny výsledky pro každý subjekt budou průběžně prezentovány a diskutovány na setkáních konaných každý týden na ambulanci UPCI. Subjekty budou monitorovány během cyklu podávání dendritických buněk; jednou týdně po každém podání dendritických buněk po dobu devíti týdnů, poté jednou měsíčně po zbytek roku (viz schematické obrázky v příloze, oddíl 6.8).

3.2.3 Příprava autologní kontrolní vakcíny s dendritickými buňkami Autologní DC budou generovány z monocytů, odvozených z produktu leukaferézy. Leukaferéza bude provedena na kterémkoli z následujících míst: 1) MUH-CTRC; 2) jednotka leukaferézy UPCI; nebo 3) umístění centrální krevní banky v Pittsburghu v centru města. Výrobek bude ručně přenášen do IMCPL umístěné uvnitř Hillman Cancer Center v Shadyside zdravotní sestrou účastnící se výzkumné studie. V době odběru, bezprostředně po leukaferéze, bude vzorek kódován sestrou pomocí stejného kódu přiděleného pacientovi při zápisu. V IMCPL budou monocyty separovány elutriací v uzavřeném systému ELUTRA. Monocyty budou kultivovány v uzavřeném systému Aastrom Replicell System v přítomnosti IL-4 a GM-CSF za účelem generování DC. V den 6 kultivace budou DC sklizeny a zkontrolovány na životaschopnost a čistotu. Alikvot čerstvě vytvořených DC bude použit pro přípravu kontrolní DC vakcíny, zatímco zbývající DC budou alikvotovány do sterilních kryozkumavek a kryokonzervovány pro přípravu následujících vakcín. Vypočítali jsme, že pro přípravu vakcíny obsahující 1 x 107 životaschopných kontrolních dendritických buněk nebo iDC (budou popsány níže) pro každý porod (jedno ošetření definované jako 1 x 107 dendritických buněk injikovaných do čtyř intradermálních míst anatomicky-proximálně od slinivky břišní) jsme bude potřebovat celkem ~5 x 107 nezralých dendritických buněk. Toto je minimální odhad počtu buněk, protože budou zapotřebí další alikvoty DC pro testování před uvolněním vakcíny pro podávání. Buňky budou testovány na životaschopnost, sterilitu (bakteriální aerobní a anaerobní kultury a Gramovo barvení), hladinu endotoxinů a mykoplazmat, jak rutinně provádí IMCPL pro buněčné produkty používané pro humánní terapii na UPCI. Pro každou vakcínu budou DC sklizeny, spočítány, upraveny na alikvoty 2,5 x 106 buněk/ml v PBS s každým alikvotem a rozděleny do 1ml tuberkulinové stříkačky pro budoucí intradermální podání.

3.2.4 Příprava iDC vakcíny ošetřené oligonukleotidy (cukrovku supresivní) Pro přípravu iDC preparátu se zahrnutím antisense oligonukleotidů budou použity stejné postupy jako pro generování kontrolních DC ve stejnou dobu, jako když budou GM-CSF a IL-4 být přidány k DC progenitorům. Progenitory budou ošetřeny ex vivo každým z antisense oligonukleotidů na konečnou koncentraci 3,3 uM podle SOP # CPL-0170 (přiloženo). V den 6 kultivace budou DC sklizeny a zkontrolovány na životaschopnost a čistotu. Po rozsáhlém promytí, aby se odstranily zbývající oligonukleotidy z kultivačního média, bude iDC zpracován identicky jako výše, rozdělen do alikvotů pro podávání a každý alikvot pak bude kryokonzervován pro budoucí podávání.

3.2.5 Kontrola a bezpečnost vakcíny iDC Vakcína bude připravena a podána pacientům se zavedeným diabetem 1. typu splňujícím kritéria uvedená v části 4.0-4.1. Vakcíny s dendritickými buňkami budou vyráběny v IMCPL, zařízení cGMP, které je v souladu s doporučeními FDA pro buněčné produkty vytvořené pro terapii pacientů. Vzorky a buněčné produkty budou vždy identifikovány stejným náhodně vygenerovaným kódem přiděleným v době leukaferézy.

3.2.6. Hodnocení bezpečnosti: Zpočátku bude 15 pacientů (ve věku 18-35 let) s prokázaným diabetem randomizováno k podání buď kontrolní vakcíny proti dendritickým buňkám (7/15 jedinců) nebo iDC (8/15 jedinců) v CHP GCRC. Randomizace bude provedena pomocí makra (SUGI26) vyvinutého pro statistický balík SAS. SUGI26 je modifikací základního adaptivního randomizačního postupu a umožňuje nestejné alokační poměry mezi více léčebnými skupinami pro kategorické kovariáty.

Po vytvoření randomizovaných pacientů do každé léčebné skupiny může pacient dostat jedno ze dvou provedení dendritických buněk (kontrolní DC nebo iDC). Tito pacienti dostanou 1 x 107 dendritických buněk intradermálně (čtyři injekce po 2,5 x 106 na čtyřech různých místech anatomicky blízko slinivky břišní) v časech znázorněných v SEKCI 3.2.1.1 a ve schematickém kreslení (viz Příloha, Část 6.8 ) pro celkem čtyři podání vakcíny rozložené každé dva týdny po dobu osmi týdnů. Pro každé podání určíme 4 jedinečná místa pro intradermální injekci uvnitř přední břišní stěny kolmo nad fyzickou lokalizací žaludku. Tato čtyři místa budou v kvadrantu 3-4 čtverečních palců. Buňky budou podávány tuberkulinovou stříkačkou připojenou k 27g-1/2 jehle pod vyvýšeným "puchýřkem" kůže na každém ze 4 jednotlivých míst vpichu. Pokud po prvním cyklu vakcíny u příjemců DC není pozorována toxicita 3. nebo 4. stupně, budou následná vakcinace provedena podle plánu. Toxicita omezující dávku bude definována jako stejná nebo vyšší než stupeň 2 s následujícími výjimkami: zimnice, malátnost a horečka nejsou považovány za limitující dávku. Všechny toxicity stupně 4 budou limitující dávku, s výjimkou lymfocytopenie. Aby byli pacienti chráněni před závažnými nežádoucími účinky terapie, bude dodržováno pravidlo zastavení, jak je popsáno v části 3.3.2 níže. Po proceduře leukaferézy bude pacient sledován na normoglykémii a v případě potřeby mu bude podán inzulín podle potřeby k udržení normoglykemických hladin. Glykemie bude také monitorována na konci každého postupu podávání DC a v případě potřeby může být podán inzulín k obnovení normoglykémie.

3.2.7 Toxicita omezující dávku:

Následující jsou považovány za toxicitu omezující dávku (DLT). Pokud se zdá, že tyto toxicity souvisí s podáním vakcíny s autologními dendritickými buňkami, budou jednotliví jedinci okamžitě vyřazeni ze studie a nebudou jim podávány žádné další injekce:

• ≥ bronchospasmus 2. nebo vyššího stupně,
• ≥ alergická reakce 2. nebo vyššího stupně nebo generalizovaná kopřivka,
• ≥ autoimunitní onemocnění 2. nebo vyššího stupně jiné než diabetes,
• ≥ Reakce v místě vpichu 2. stupně v důsledku testování vakcíny nebo DTH,
• ≥ Hematologická a nehematologická toxicita 3. nebo 4. stupně
• Toxicita 2. stupně, která neustoupí do 5 dnů po podání vakcíny proti dendritickým buňkám
• Zpoždění dávkování > 4 týdny

Terapie může být přerušena z následujících důvodů:

• Interkurentní onemocnění, které brání dalšímu podání vakcíny s autologními dendritickými buňkami, včetně průkazu infekčního (bakteriálního/virového) onemocnění
• Nepřijatelné nežádoucí účinky,
• Pacient se rozhodne ze studie odstoupit, popř
• Obecné nebo specifické změny ve stavu pacienta činí pacienta nepřijatelným pro další léčbu podle posouzení zkoušejícího, sestry nebo ošetřujícího lékaře (lékařů).

3.3 SBĚR DAT A STATISTICKÉ ÚVAHY 3.3.1 Obecné úvahy Půjde o bezpečnostní studii k vyhodnocení bezpečnosti a proveditelnosti podávání vakcíny proti diabetu supresivních dendritických buněk založené na autologních dendritických buňkách ošetřených ex vivo fosforothioátem modifikovanými antisense oligonukleotidy zaměřenými na primární transkripty CD40, CD80 a CD86 ko- stimulační molekuly. Vakcína bude podána intradermálně a každá vakcína bude obsahovat 1 x 107 autologních dendritických buněk. Každému oprávněnému subjektu budou dodány celkem 4 vakcíny. Pro zajištění dostatečného počtu DC budou provedeny leukaferézy (14 dní před první vakcínou).

Zkouška je navržena tak, aby zajistila, že míra toxicity je přijatelně nízká, aby zaručila další studium buněčné vakcíny ve zkouškách účinnosti.

4.5.1 MONITOROVÁNÍ KLINICKÉHO ZKOUŠENÍ

4.5.1.1 Hlášení závažných nežádoucích příhod (SAE)

NEŽÁDOUCÍ UDÁLOSTI: Obecně budou všechny nežádoucí události zaznamenány a sděleny bezpečnostnímu důstojníkovi, PI a DSMB do 24 hodin od jejich výskytu. Bezpečnostní technik určí, zda se má DSMB sejít v rámci nouzové relace. Jakákoli hlášení nezávažných nežádoucích účinků budou předložena IRB do 24 hodin od zasedání DSMB. Výroční a závěrečné zprávy DSMB budou rovněž předloženy IRB a FDA do 48 hodin od jednání.

Hlášení závažných nežádoucích příhod (SAE)

Všechny (SAE) budou zaznamenány na standardních listech toxicity a oznámeny FDA, IRB, bezpečnostnímu úředníkovi DSMB, hlavnímu zkoušejícímu (Dr. Trucco) a/nebo spoluvyšetřovatelé (Dr. Finegold, Whiteside nebo Giannoukakis) do 24 hodin od výskytu. Všechny závažné nežádoucí příhody a preexistující zdravotní stavy, které se během léčby neočekávaně zhorší, budou zaznamenány a hlášeny, jak je popsáno bezprostředně výše (DSMB, bezpečnostní důstojník DSMB, PI, FDA, IRB). Všechny závažné nežádoucí příhody nebo úmrtí, ke kterým dojde po třiceti (30) dnech a u kterých je přiměřeně pravděpodobné, že budou souviset s kontrolou nebo podáním iDC, budou hlášeny do 24 hodin od události bezpečnostnímu úředníkovi, FDA a celému DSMB. Jakékoli závažné nebo nežádoucí příhody nebo úmrtí, ke kterým dojde do třiceti (30) dnů od posledního kontrolního podání DC nebo iDC, budou hlášeny stejně. Bezpečnostní referent svolá celou schůzi DSMB do 24 hodin od výskytu jakékoli SAE. Zpráva DSMB bude poté předložena IRB a FDA nejpozději do 48 hodin po výskytu SAE.

Vážné je definováno tak, jak je popsáno v 21 CFR 312.32 (a)