Funzione delle cellule cardiache e immunitarie nella preeclampsia

Progettazione dello studio

Lo scopo generale dello studio clinico osservazionale è determinare se il fenotipo delle cellule immunitarie pro-infiammatorie osservato nelle donne con preeclampsia (PE) possa essere correlato alla funzione cardiaca durante e dopo la gravidanza e nel periodo postpartum.

Il team di studio sarà composto dalla dott.ssa Alice Christensen (dottoranda di dottorato), che acconsentirà ai pazienti all'interno del gruppo di studio e si occuperà degli aspetti clinici e di laboratorio dello studio; Dr Suchita Nadkarni (supervisore primario) che supervisionerà e formerà il Dr Christensen su tutti gli aspetti scientifici di base dello studio; Prof Steve Thornton e Dr Elena Greco (supervisori clinici) che saranno i responsabili ostetrici dello studio; I cardiologi consulenti includeranno la dott.ssa Neha Sekhri, che sarà il contatto principale per eventuali problemi cardiaci, la dott. e Barts Hospital per quanto riguarda l'ecocardiografia (eco). A tal fine, circa 100 donne incinte saranno reclutate dal Royal London Hospital.

La popolazione in studio sarà composta da 3 gruppi:

1. Pazienti preeclamptici (34 pazienti)
2. Ipertensione indotta dalla gravidanza (PIH; 33 pazienti)
3. Donne incinte sane (33)

I pazienti normotesi e PIH saranno confrontati per età gestazionale con i pazienti con EP. Gli studi di ecocardiografia e risonanza magnetica cardiovascolare (CMR) senza mezzo di contrasto saranno effettuati in tutti i pazienti nello studio al momento dell'arruolamento e 3 mesi dopo il parto, supponendo che eventuali cambiamenti cardiovascolari fisiologici correlati alla gravidanza si saranno risolti per allora. La dottoressa Anna Herrey, una delle maggiori esperte di CMR nelle donne in gravidanza, supervisionerà le analisi delle immagini nello studio. Il dottor Herrey ha recentemente pubblicato un documento che delinea la sicurezza dell'esecuzione della CMR nelle donne in gravidanza e la risoluzione comparativa senza l'uso del mezzo di contrasto al gadolinio (Herrey et al 2019). La funzione cardiaca sarà valutata mediante esame ecocardiografico misurando la frazione di eiezione, la deformazione e la funzione diastolica (così come la velocità dell'onda del polso). Le caratteristiche del tessuto miocardico saranno valutate con CMR senza mezzo di contrasto (mappatura T1 e T2 e valutazione volumetrica completa, il gold standard per l'analisi della funzione ventricolare sinistra (Bellenger et al 2000 e Grothues et al 2002)). Qualsiasi paziente all'interno del gruppo di studio che dimostri alterazioni cardiache anormali a 3 mesi dopo il parto verrà indirizzato al dottor Sekhri per un follow-up di 6 mesi (sotto la cura NHS in questo momento). Tutte le scansioni cardiache saranno eseguite in regime ambulatoriale presso il Barts Hospital ad eccezione delle donne con EP grave dove l'ecocardiografia verrà eseguita al letto del paziente, al momento del ricovero in reparto. Pertanto, queste donne non avranno studi CMR all'arruolamento ma saranno invitate a partecipare al follow-up a 3 mesi per studi CMR ed ecocardiografia.

Verranno prelevati campioni di sangue dai pazienti per valutare i fenotipi delle cellule immunitarie. Verranno raccolti campioni di plasma per l'analisi dei fattori cardiaci specifici (BNP, troponina) e per la misurazione degli ormoni steroidei (progesterone ed estradiolo) e dei mediatori solubili dell'infiammazione e dell'antinfiammatorio. Al fine di limitare i bias all'interno dello studio, tutte le analisi delle immagini CMR (eseguite dal dottor Herrey) saranno in cieco. Il dottor Sekhri sarà disponibile per la seconda segnalazione per valutare la variabilità interosservatore degli studi CMR. Se dovesse emergere una differenza tra PE ad insorgenza precoce e tardiva (PE che si sviluppa rispettivamente prima e dopo 34 settimane di gestazione), i sottogruppi verranno analizzati all'interno del gruppo PE. Questo studio pilota iniziale informerà i calcoli di potenza per ulteriori studi sulla malattia ad esordio precoce e tardivo.

Procedure di studio

Procedure di follow-up

Tutti i pazienti reclutati per lo studio, ad eccezione di quelli con EP grave, saranno seguiti come pazienti ambulatoriali presso The Royal London e verrà chiesto di partecipare a una visita ospedaliera al Barts Hospital per studi CMR.

Ritiro del partecipante

I partecipanti avranno la possibilità di presentare una richiesta scritta per essere ritirati dalla sperimentazione in qualsiasi momento. I partecipanti avranno anche la possibilità di revocare il consenso a un'ulteriore partecipazione, circostanza in cui non verranno raccolti ulteriori dati per l'inclusione. Nel malaugurato caso in cui un partecipante perda la capacità, le informazioni raccolte continueranno ad essere utilizzate ma non verranno registrati ulteriori dati.

Gli investigatori chiederanno inoltre ai partecipanti se possono conservare le loro informazioni di contatto in modo che gli investigatori possano contattarli per prendere parte a ricerche future relative allo studio in corso. Tale richiesta verrà posta nel modulo di consenso.

Definizione di fine studio

La fine dello studio sarà definita dal raggiungimento del numero di pazienti proposto per gruppo di pazienti (indicato sopra).

Considerazioni statistiche

Poiché si tratterà di uno studio pilota, i ricercatori non possono eseguire calcoli di potenza sul numero di pazienti necessari. i numeri per ciascun gruppo di pazienti sono stati scelti in base al numero realistico di pazienti che si ritiene possano essere reclutati nel periodo iniziale di 1 anno e nei successivi studi di follow-up su questi pazienti.

Metodo di analisi

Con il supporto della nostra struttura locale di bioinformatica e bio-repository NIHR (http://www.whri.qmul.ac.uk/core-facilities/nihr-bioinformatics-and-bio-repository), più parametri saranno analizzati utilizzando più confronti di gruppo (ANOVA) per aumentare la potenza. Al fine di limitare i bias all'interno dello studio, tutte le analisi delle immagini CMR (eseguite dal Dr Herrey e dal Dr Sekhri) saranno in cieco e verrà misurata la variabilità interosservatore.

Gli investigatori utilizzeranno la citometria a flusso per analizzare il fenotipo delle cellule immunitarie. Questo è un metodo consolidato. Il laboratorio del dottor Nadkarni ha accesso a una struttura centrale di citometria a flusso, che dispone di macchine in grado di identificare fino a 12 marcatori fenotipici su una data cellula. Inoltre, la dott.ssa Nadkarni, il ricercatore capo, e il suo gruppo, hanno una vasta esperienza nella fenotipizzazione delle cellule immunitarie utilizzando questo metodo. I principali vantaggi sono:

1. È il gold standard per la fenotipizzazione delle cellule immunitarie
2. È necessaria una quantità minima di sangue (max 200 μl)
3. Gli anticorpi sono disponibili in commercio e sono stati ampiamente convalidati da noi stessi e da altri
4. Il dott. Nadkarni ha sviluppato un metodo ad alta produttività per analizzare molti campioni contemporaneamente, riducendo così al minimo gli errori di manipolazione

Tutti i campioni verranno elaborati e analizzati entro 1 ora dalla raccolta del campione per ridurre al minimo la degradazione delle proteine ​​sulla superficie delle cellule immunitarie.

I ricercatori propongono anche di esaminare i fattori circolanti nel plasma e ciò sarà effettuato utilizzando kit ELISA disponibili in commercio.

L'endpoint primario sarà determinare se esiste una correlazione tra fenotipi di cellule immunitarie aberranti e funzione cardiaca anormale all'interno della nostra coorte di pazienti con preeclampsia, rispetto ai normali gruppi sani e PIH. Inoltre, verranno condotte analisi per trovare differenze funzionali e fenotipiche cardiache statisticamente significative tra le nostre coorti di pazienti preeclamptiche e PIH, che miglioreranno la nostra comprensione della funzione cardiaca tra i gruppi di pazienti.

Etica

La domanda per lo studio attuale è in attesa dopo la presentazione. Il consenso informato sarà ottenuto e registrato come descritto sopra. Le indennità per gruppi speciali sono dettagliate sopra.

Risultati accidentali

Qualora nel corso dello studio dovessero sorgere risultati accidentali di rilevanza clinica, il medico di famiglia e il team di assistenza clinica dei partecipanti ne saranno informati. Il consenso a contattare il medico di famiglia sarà richiesto durante il processo di iscrizione.

Rapporto annuale sulla sicurezza

L'IC invierà una relazione annuale sui progressi al REC e allo sponsor utilizzando il modello HRA nell'anniversario del "parere favorevole" del REC.

Gestione dati

Tutti i dati generati verranno archiviati in un foglio di calcolo Excel che combina dati clinici e di laboratorio. Il foglio di calcolo sarà protetto da password memorizzato con un disco rigido sicuro su un computer protetto. L'accesso alla password e ai dati sarà strettamente necessario. Verrà predisposto un audit trail completo.

Dati di origine

I dati di origine per questo studio comprenderanno le diagnosi iniziali di preeclampsia o ipertensione indotta dalla gravidanza, che saranno ottenute dal team di assistenza ostetrica, guidato dalla dott.ssa Elena Greco presso il Royal London. Questi saranno sotto forma di risultati degli esami del sangue e/o scansioni di immagini della gravidanza.

I successivi dati di origine saranno immagini CMR scattate al punto temporale iniziale (diagnosi di preeclampsia e controlli corrispondenti all'età gestazionale) e dati di immagini CMR di follow-up al secondo punto temporale dello studio (3 mesi dopo il parto). Oltre alle immagini CMR, i dati di origine saranno ottenuti anche dalla fenotipizzazione di laboratorio dei campioni di sangue prelevati dai pazienti nei punti temporali sopra menzionati.

Gli investigatori che sono direttamente coinvolti nello studio avranno accesso ai dati di origine. In alcuni casi, laddove sia ritenuto migliore per il paziente e per le sue cure in corso, i medici possono chiedere consiglio ad altri esperti, che potrebbero richiedere il loro accesso ai dati di origine.

Riservatezza

Gli investigatori intraprenderanno la pseudorandomizzazione, in base alla quale il paziente sarà identificabile solo dal numero dell'ospedale. Poiché si tratterà di uno studio di follow-up, i ricercatori dovranno collegare il paziente e quindi questo studio non sarà completamente anonimo.

Conservazione e archiviazione dei record

I dati e la documentazione dello studio saranno archiviati in conformità con i requisiti normativi pertinenti e le SOP del sito.

Un identificatore alfanumerico univoco del paziente verrà assegnato a ciascun partecipante all'inizio dello studio. I dati verranno archiviati utilizzando gli identificatori univoci dei partecipanti su un database sicuro. I dati non saranno conservati su personal computer. I documenti riservati saranno conservati in un armadio chiuso a chiave situato in una stanza sicura. Le note cliniche saranno gestite secondo il protocollo di fiducia. Il Data Protection Act e il codice di condotta sulla riservatezza del NHS saranno rispettati durante questo studio. I dati possono essere condivisi con i membri del team clinico per consentire l'assistenza clinica continua.

Le linee guida GCP richiedono che lo sperimentatore o l'istituzione conservi tutti i moduli di segnalazione dei casi e tutti i documenti di origine che supportano i dati raccolti da ciascun partecipante oltre a tutta la documentazione dello studio. Saranno prese misure per prevenire la distruzione accidentale o prematura di questi documenti. I documenti essenziali devono essere conservati per almeno 20 anni. È responsabilità dello sponsor informare lo sperimentatore quando questi documenti non devono più essere conservati. Se l'investigatore responsabile va in pensione o lascia l'istituzione, la responsabilità della documentazione deve essere trasferita a una persona che accetterà la loro custodia

Preparazione e raccolta dei campioni

Verranno raccolti campioni di sangue per valutare i fenotipi delle cellule immunitarie da pazienti che hanno letto il foglio informativo e firmato il modulo di consenso. il giorno della risonanza magnetica cardiaca. Un volume massimo di 15 ml verrà prelevato dal paziente in qualsiasi momento e raccolto in tubi di citrato di sodio.

Procedure di laboratorio

La maggior parte dei campioni di sangue sarà sottoposta ad analisi fenotipiche utilizzando il metodo della citometria a flusso. In breve, 50 microlitri di sangue saranno marcati con anticorpi disponibili in commercio che sono coniugati a fluorocromi che possono essere rilevati dai laser sul citometro a flusso. Un software specializzato consentirà l'analisi della valutazione dei marcatori fenotipici espressi sulle cellule immunitarie.

I campioni saranno anche isolati per specifiche cellule immunitarie, inclusi neutrofili e cellule T, che saranno conservate in un congelatore sicuro a -80°C e potranno essere successivamente utilizzate per test genetici, inclusa la prossima generazione e il sequenziamento dell'intero genoma. Un sequenziamento così profondo ci consentirà di valutare i cambiamenti genetici che possono verificarsi insieme ai cambiamenti fenotipici nelle cellule immunitarie.

Il plasma sarà raccolto anche da questi campioni per valutare i fattori circolanti, da valutare mediante kit disponibili in commercio.

Stoccaggio e trasferimento del campione

I campioni di sangue saranno prelevati dal ricercatore, la dott.ssa Alice Christensen, presso il Barts Heart Center, dove verranno eseguite le risonanze magnetiche cardiache. I campioni saranno conservati in un frigorifero NHS fino al trasferimento in laboratorio. Il Barts Heart Center è a un massimo di dieci minuti a piedi dal William Harvey Research Institute, dove ha sede il laboratorio. I campioni saranno trasferiti dal Dr Christensen al laboratorio utilizzando scatole di trasferimento sicure per campioni da portare al laboratorio. Tutti i campioni di sangue verranno processati entro un'ora dalla raccolta.

Segnalazione di sicurezza

A causa della natura osservazionale e del disegno di questo studio, non si verificheranno segnalazioni di eventi avversi sulla sicurezza.

Monitoraggio e controllo

Lo Sponsor o il delegato si riserva il diritto di controllare qualsiasi studio, centro di studio o struttura centrale. Inoltre, qualsiasi parte dello studio può essere verificata dai finanziatori, ove applicabile.

Il monitoraggio in loco sarà eseguito secondo il piano di monitoraggio dello studio. Il monitoraggio includerà la verifica dei dati di origine.

Il monitoraggio del centro può essere effettuato da uno o più monitor dello studio addestrati, per verificare la documentazione dello studio.