Endomikroskopia i chłoniak MALT żołądka

Wprowadzenie

Pozawęzłowy chłoniak strefy brzeżnej B-komórkowej (MZBL) tkanki limfatycznej związanej z błoną śluzową (chłoniak MALT) jest najczęstszą postacią chłoniaka pozawęzłowego [1, 2]. Chociaż chłoniak MALT może obejmować różne narządy, żołądek jest miejscem predylekcji tej złośliwej choroby. Około 90% chłoniaków typu MALT żołądka jest związanych z zakażeniem Helicobacter pylori (HP) [3], a eradykacja patogenu prowadzi do regresji nowotworu u dużego odsetka pacjentów we wczesnych stadiach nowotworu [4, 5]. Nawroty po eradykacji HP i pierwotne zaawansowane stadium nowotworu wymagają leczenia chemioterapeutycznego, radioterapii, aw niektórych przypadkach operacji [6]. Po całkowitej remisji należy wykonać badania kontrolne do końca życia w celu wykrycia nawrotów [7].

Histologicznie chłoniak MALT charakteryzuje się naciekaniem blaszki właściwej przez chłoniakowe komórki podobne do centrocytów, które rozprzestrzeniają się do otaczających warstw błony śluzowej [8]. W immunohistochemii wykazują właściwości barwienia CD 20 dodatniego. Kiedy rozprzestrzeniają się do węzłów chłonnych lub śledziony, gromadzą się zazwyczaj w strefie brzeżnej (z tego powodu klasyfikowane są jako „chłoniaki strefy brzeżnej”) [2]. Rozsiew do innych narządów, zwłaszcza do innych miejsc błony śluzowej, może wystąpić często, dlatego wymagana jest szczegółowa diagnostyka podczas oceny zaawansowania i obserwacji chłoniaka MALT. Rozprzestrzenianie się w przewodzie pokarmowym (przewód pokarmowy), na przykład do jelita cienkiego, jest rzadkie, ale można je bardzo łatwo ocenić za pomocą standardowych procedur endoskopowych, jak ostatnio opisano w naszym oddziale [9].

W przypadku chłoniaka MALT-żołądka gastroskopia z oceną biopsji jest obecnie badaniem kontrolnym z wyboru. Należy pobrać losowo wiele biopsji ze wszystkich miejsc w żołądku, a zwłaszcza ze wszystkich podejrzanych zmian. Niedawne osiągnięcia w zakresie poprawy kontrastu tkankowego podczas badań endoskopowych (na przykład chromoendoskopia lub obrazowanie wąskopasmowe) pomogły wykryć zmiany chorobowe związane z chłoniakiem MALT. Niemniej jednak wskaźniki wykrywalności prawie się nie zmieniły, ponieważ wszystkie te techniki opierają się na obecności cech powierzchownych[10].

Techniką endoskopową pozwalającą na ocenę głębszych warstw ściany jest ultrasonografia endoskopowa. W ostatnich latach stała się ważnym narzędziem zmieniającym w diagnostyce chłoniaka MALT-żołądka. Chociaż dostarcza istotnych informacji o głębokości naciekania guza i zajęciu węzłów chłonnych w kontekście procedur oceny stopnia zaawansowania, nie może zastąpić oceny histologicznej podczas obserwacji, ponieważ wyniki badań endosonograficznych nie wykazują dobrej korelacji z wynikami histologicznymi w czasie [11, 12].

Najnowszym osiągnięciem wprowadzonym w endoskopowym leczeniu przewodu pokarmowego jest tzw. laserowy endomikroskop konfokalny (CLE). Mikroskopia konfokalna została opracowana przez Marvina Minsky'ego pod koniec lat pięćdziesiątych. Jego zasadą jest mikroskopowe skanowanie ognisk znajdujących się pod powierzchnią obiektu. W porównaniu z konwencjonalną mikroskopią świetlną wykorzystuje specjalny system filtrów, aby uniknąć nakładania się obrazu przez otaczającą tkankę. Mówiąc szczegółowo, źródło światła (zwykle laser) jest ogniskowane przez obiektyw mikroskopu w punkcie o ograniczonej dyfrakcji na lub wewnątrz obiektu. Światło rozproszone lub wzbudzone fluorescencją (uzyskane na przykład poprzez barwienie fluoresceiną) i wyemitowane w ognisku w próbce częściowo powróci przez optykę wzdłuż ścieżki, z której przybyło. Rozdzielacz wiązki umieszczony na ścieżce odbija światło powrotne w kierunku detektora. Optyka skupi światło od ogniska w próbce do ogniska koniugatu w pobliżu detektora (stąd technologia nazywana jest „konogniskową”). Tutaj filtr przestrzenny („otworek”) jest używany do gaszenia całego światła pochodzącego z obszarów poza ogniskiem. Odbicia światła od samego ogniska zostaną przekazane do detektora, który jest podłączony do systemu komputerowego, który digitalizuje sygnał optyczny i tworzy obraz histologiczny in vivo [13].

Koncentrując się na jej wpływie klinicznym, mikroskopia konfokalna jest pierwszą techniką umożliwiającą ocenę in vivo struktur tkankowych pod ich powierzchnią. Dzięki wielu przełomom w miniaturyzacji (głównie w latach 90. XX wieku) technologia ta mogła zostać zastosowana do światła przewodu w gastroenterologii, zintegrowana ze standardowym endoskopem. Pozwala na histologiczną wizualizację in vivo górnych 250 mikrometrów wszystkich ścian przewodu pokarmowego, dodatkowo do normalnej funkcji endoskopii w świetle białym (zapewnianej przez dwa oddzielne ekrany na górze stacji roboczej) [13].

Wizualizacja in vivo różnych patologii przewodu pokarmowego doprowadziła do pierwszych publikacji na temat klinicznego zastosowania CLE. Kiesslich i wsp., jako jeden z pionierów tej techniki, opublikowali przypadek obrazowania na żywo Helicobacter pylori metodą CLE w żołądku [14]. W naszym oddziale niedawno zgłosiliśmy wyniki badania endomikroskopowego pacjenta z chorobą Whipple'a. Wykrywanie makrofagów piankowatych w blaszce właściwej, które były wyraźnie odróżnialne od komórek kubkowych w otaczającym CLE, może zapewnić histologię in vivo na poziomie pojedynczej komórki [15].

Oceniając patologie przewodu pokarmowego w bardziej systematyczny sposób, pojawiło się wiele publikacji traktujących o zastosowaniu CLE w kontekście badań kontrolnych stanów predysponujących do rozwoju nowotworów złośliwych. Dla przełyku Barretta, na przykład, Kiesslich i in. stwierdzili wysokie wskaźniki czułości i specyficzności w wykrywaniu metaplazji Barretta, jak również w przewidywaniu zmian nowotworowych związanych z Barrettem – dla obu wyników obrazy pochodzące z CLE porównano z konwencjonalną histologią [16]. W pierwszym prospektywnym, randomizowanym, podwójnie ślepym, kontrolowanym badaniu krzyżowym Dunbar i in. udowodnili te wyniki, ponieważ biopsje ukierunkowane na CLE miały wyższą wydajność diagnostyczną w przypadku nowotworu przełyku Barretta niż standardowa endoskopia z losową biopsją 4-kwadrantową [17]. Podobne wyniki zostały już opublikowane dla pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego, którzy byli rutynowo badani pod kątem raka okrężnicy. Można wykazać, że CLE jest użytecznym narzędziem poprawiającym wydajność diagnostyczną. Jednocześnie pomogło dokładniej wykonać konwencjonalne biopsje, co może oszczędzić pacjentom niepotrzebnych biopsji [18].

Połączenie potencjału CLE w zakresie poprawy wydajności diagnostycznej podczas nadzoru z jego właściwościami skanowania górnych 250 µm ściany przewodu pokarmowego (co odpowiada prawie całej głębokości błony śluzowej) sprawia, że ​​jest to idealne narzędzie do postępowania diagnostycznego w przypadku chłoniaka MALT żołądka , gdzie patologie zwykle wywodzą się z blaszki właściwej, głębszej warstwy błony śluzowej [8].

Cele studiów

W tym pilotażowym badaniu klinicznym badacze zamierzają zbadać pacjentów z chłoniakiem MALT żołądka za pomocą laserowej endomikroskopii konfokalnej (CLE) w kontekście oceny stopnia zaawansowania lub dalszych endoskopii. Według naszej wiedzy nie przeprowadzono jeszcze żadnego systematycznego badania dotyczącego stosowania CLE u pacjentów z chłoniakiem MALT.

• Celem badaczy jest ustalenie, czy diagnoza chłoniaka MALT może być postawiona poprzez ocenę endomikroskopowych cech podejrzanych zmian zarówno w żołądku, jak iw jelicie cienkim, ponieważ te części przewodu pokarmowego są łatwo dostępne podczas endoskopii górnego odcinka przewodu pokarmowego. Konwencjonalne biopsje z obserwowanych części przewodu pokarmowego powinny służyć jako porównywalny złoty standard.
• Uwzględniając wyniki badań endomikroskopowych pacjentów z przewlekłym zapaleniem błony śluzowej żołądka, gruczolakorakiem żołądka i zdrowych osobników jako grupy kontrolnej, badacze dążą do ustalenia markerów swoistych dla chłoniaka MALT, które można wykorzystać do „bez biopsji” diagnozy choroby in vivo.

Projekt badania

Prospektywne badanie kliniczne bez randomizacji i zaślepienia

Badana populacja

Pacjenci kierowani do naszego oddziału na endoskopię górnego odcinka żołądka w kontekście oceny stopnia zaawansowania lub obserwacji chłoniaka MALT żołądka.

Kryteria wyłączenia:

• pacjenci uczuleni na jeden ze składników leku (w tym leki stosowane w celu uspokojenia świadomości, takie jak propofol lub midazolam oraz fluoresceina, barwnik fluorescencyjny stosowany w CLE)
• odmowa udziału w badaniu
• wiek pacjenta poniżej 18 lat

Metody

Badanie to będzie wykonywane na Oddziale Gastroenterologii i Hepatologii Oddziału Chorób Wewnętrznych III., w ścisłej współpracy z Oddziałem Onkologii Oddziału Chorób Wewnętrznych I. oraz Klinicznym Instytutem Patologii Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu.

Ponieważ to badanie zostało zaplanowane jako próba pilotażowa, skupia się głównie na jakościowych cechach endomikroskopowych uzyskanych z naszych badań w celu uzyskania referencyjnych patologii do dokładnej diagnozy w przyszłości. Niemniej jednak zostanie przeprowadzona analiza ilościowa poprzez porównanie diagnoz pochodzących z CLE z wynikami histologicznymi w celu obliczenia czułości i swoistości diagnozy chłoniaka MALT opartej na CLE. W oparciu o obecne wskaźniki zachorowalności i nawrotów choroby, badacze oszacowali, że obejmują 50 pacjentów, aby uzyskać miarodajną próbkę pacjentów do analizy jakościowej i ilościowej. Biorąc pod uwagę obecną liczbę pacjentów z chłoniakiem MALT, którzy przechodzą endoskopię w ośrodku badawczym w celu oceny stopnia zaawansowania lub obserwacji, ta próbka pacjentów może zostać włączona w okresie dwóch lat.

Wszyscy pacjenci, którzy spełniają wymienione kryteria włączenia, otrzymają formularz informacyjny dla pacjenta dotyczący tego badania wraz ze zwykłym formularzem świadomej zgody na odpowiednie badanie endoskopowe, któremu mają zostać poddani. Informacje o pacjencie zostaną podane co najmniej 24 godziny przed interwencją, zgodnie z praktyką w naszym oddziale. Jeśli pacjent wyrazi zgodę na udział w badaniu, zostanie przygotowany do endoskopii naszym laserowym endomikroskopem konfokalnym (Pentax EC3870K z procesorem endomikroskopii konfokalnej ISC-1000 – Pentax, Tokio, Japonia oraz Optiscan Pty Ltd, Notting Hill, Victoria, Australia) przez podanie dożylne propofolu i/lub midazolamu stosowanego rutynowo do świadomej sedacji podczas zabiegów endoskopowych na naszym oddziale. Dodatkowo podaje się dożylnie 5-10 ml 10% roztworu soli sodowej fluoresceiny w celu wzmocnienia fluorescencji tkanek podczas endomikroskopii.

Wszystkie leki będą podawane przez lekarzy specjalistów, asystentów lekarskich lub dyplomowane pielęgniarki, zgodnie z rutynową praktyką w naszej placówce.

Przechwytywanie obrazu CLE rozpocznie się w najgłębszym dostępnym punkcie jelita cienkiego. W czasie cofnięcia endoskopu zdjęcia CLE będą wykonywane co 10 centymetrów w jelicie cienkim, następnie z antrum i trzonu żołądka oraz z przełyku. Ponadto CLE będzie stosowane w przypadku wyraźnie wyglądających obszarów, podejrzanych o patologiczne pochodzenie. Wszędzie tam, gdzie uzyskiwane są obrazy CLE, konwencjonalna biopsja zostanie pobrana z tej samej lokalizacji.

Obrazy CLE będą rutynowo rejestrowane i przechowywane przy użyciu naszego standardowego systemu zarządzania danymi. Zostaną one ocenione natychmiast podczas zabiegu endoskopowego wraz z certyfikowanym przez komisję patologiem przewodu pokarmowego, który ustali wstępną diagnozę.

Konwencjonalne biopsje będą przetwarzane i oceniane zgodnie z kryteriami przedstawionymi w najnowszej klasyfikacji WHO dla chłoniaka MALT. U wszystkich pacjentów zostanie przeprowadzone fenotypowanie immunologiczne skrawków parafinowych w celu wykazania restrykcji łańcucha lekkiego i fenotypu CD20+CD5-CD10-cyklinaD1-, który w kontekście obrazu mikroskopowego jest zgodny z chłoniakiem MALT. Ponadto wszyscy pacjenci zostaną poddani ocenie pod kątem translokacji swoistych dla chłoniaka MALT, zwłaszcza t(11;18)(q21;q21).

Kontrole endomikroskopowe (pacjenci z przewlekłym zapaleniem błony śluzowej żołądka, gruczolakorakiem żołądka oraz osoby zdrowe) zostaną zebrane na podstawie aktualnych danych z zabiegów endomikroskopowych wykonanych już w ramach rutynowych badań.

Na koniec badania wszystkie obrazy CLE i wycinki histologiczne zostaną ocenione oddzielnie przez dwóch certyfikowanych patologów z zaślepioną płytą. W przypadku rozbieżnych diagnoz wspólnie przeanalizują poszczególne przypadki, aby dojść do porozumienia w sprawie ostatecznej diagnozy. Wszystkie przypadki, w których początkowa i ostateczna diagnoza odbiegają od siebie, zostaną wspólnie ponownie ocenione przez wszystkich zaangażowanych specjalistów.

Implikacje etyczne

Laserowa endomikroskopia konfokalna jest nową, bezpieczną techniką, która została już przebadana w badaniach klinicznych [16, 17]. Jej bezpieczeństwo gwarantuje zastosowanie światła laserowego o niskim natężeniu, które w najgorszym przypadku może spowodować miejscowe wybielenie komórek zawierających fluoresceinę, co jest nieszkodliwe, odwracalne, a nawet stosowane jako znak diagnostyczny w warunkach eksperymentalnych [13].

Ten protokół badania został już zatwierdzony przez komisję etyczną Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu. Wszystkie procedury w kontekście tego badania będą wykonywane zgodnie z Deklaracją Helsińską oraz wytycznymi Dobrej Praktyki Naukowej (GSP) Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu.

Oczekiwany wpływ i perspektywy

Jeśli badacze znajdą markery swoiste dla chłoniaka MALT, które można wykorzystać do diagnostyki in vivo „bez biopsji”, może to doprowadzić do kolejnego ograniczenia inwazyjnych procedur u pacjentów dotkniętych chorobą, co może mieć istotny wpływ kliniczny, ponieważ ocena biopsji jest często ograniczone raczej złym stanem krzepnięcia pacjentów onkologicznych.

Jeśli cele badania zostaną poparte wynikami tego badania pilotażowego, zostanie przeprowadzone randomizowane badanie kontrolowane porównujące diagnostykę in vivo z konwencjonalną oceną histologiczną w kwestiach wydajności diagnostycznej.