Desenvolvimento de RNA-Seq direcionado para diagnóstico de esclerose lateral amiotrófica (ROSA)

O diagnóstico genético da Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) poderia identificar a origem da doença, permitindo potencialmente ao paciente prosseguir com terapia genética/direcionada. No entanto, muitas formas familiares de ELA não são geneticamente diagnosticadas, seja porque nenhuma variante foi detectada nos genes de interesse ou porque a(s) variante(s) detectada(s) têm significado incerto. Atualmente, o diagnóstico molecular ocorre em duas etapas: 1) Busca da expansão GGGGCC no gene C9ORF72 por RP-PCR; 2) Análise das regiões codificantes por sequenciamento de alto rendimento de um painel de 30 genes envolvidos na ELA.

Muitas dessas variantes de significado incerto afetam o splicing. O seu impacto pode ser previsto utilizando ferramentas in silico, mas apenas uma análise do ARN do paciente pode confirmar a sua natureza patogénica. Atualmente, a análise das transcrições só é feita a posteriori, quando uma variante com previsão de impacto no splicing é detectada no DNA do paciente. RT-PCR seguido de sequenciamento Sanger verifica então o impacto das variantes de splice. Este método confirmou o impacto de certas variantes de splice nos pacientes. No entanto, este método é demorado e requer desenvolvimento personalizado, além de ser dependente de mutação/gene/paciente. Em contraste, o sequenciamento de RNA de alto rendimento (RNA-Seq) analisa simultaneamente o splicing de numerosos genes, com uma abordagem global, aplicável a todos os pacientes. Esta abordagem evita o design personalizado de primers, que podem ser influenciados pela interpretação das previsões de splicing, enquanto o RNA-Seq captura e sequencia sistematicamente todas as transcrições. Finalmente, o RNA-Seq fornece informações adicionais em comparação ao sequenciamento de DNA, como a detecção de salto de exon, inclusão de íntrons e criação de transcritos de fusão.

No projeto GTEx (GTEx Consortium, 2013), os níveis de expressão de transcritos do genoma humano foram quantificados por RNA-Seq. Usando estes resultados, os investigadores do estudo mediram a expressão de transcrições de genes conhecidos da ELA no sangue total. Aplicando um valor limite de 0,5 transcrições por milhão de leituras (TPM), 25 dos 30 genes de ELA atualmente analisados ​​pelo NGS em diagnósticos de rotina no Hospital Universitário de Nîmes poderiam ser elegíveis para uma análise completa por RNA-Seq. Nenhum dos laboratórios franceses que realizam análises genéticas da ELA desenvolveu ainda o RNA-Seq como ferramenta de diagnóstico de rotina. O laboratório do estudo recebe mais de 600 solicitações de diagnóstico genético de pacientes com ELA por ano. O objetivo deste estudo é, portanto, desenvolver um método global para analisar transcrições de RNA de genes de ELA para categorizar as mutações para melhorar o manejo diagnóstico dos pacientes.