Desarrollo de RNA-Seq dirigido para el diagnóstico de esclerosis lateral amiotrófica (ROSA)

El diagnóstico genético de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) podría identificar el origen de la enfermedad, lo que potencialmente permitiría al paciente seguir una terapia génica o dirigida. Sin embargo, muchas formas familiares de ELA no se diagnostican genéticamente, ya sea porque no se ha detectado ninguna variante en los genes de interés o porque las variantes detectadas tienen un significado incierto. Actualmente, el diagnóstico molecular se realiza en dos etapas: 1) Búsqueda de la expansión GGGGCC en el gen C9ORF72 mediante RP-PCR; 2) Análisis de las regiones codificantes mediante secuenciación de alto rendimiento de un panel de 30 genes implicados en la ELA.

Muchas de estas variantes de significado incierto afectan el empalme. Su impacto se puede predecir utilizando herramientas in silico, pero sólo un análisis del ARN del paciente puede confirmar su naturaleza patogénica. Actualmente, el análisis de las transcripciones solo se realiza a posteriori, cuando se detecta en el ADN del paciente una variante que se prevé que afectará el empalme. La RT-PCR seguida de la secuenciación de Sanger verifica el impacto de las variantes de empalme. Este método confirmó el impacto de ciertas variantes de empalme en los pacientes. Sin embargo, este método requiere mucho tiempo y un desarrollo personalizado, y depende de la mutación, el gen y el paciente. Por el contrario, la secuenciación de ARN de alto rendimiento (RNA-Seq) analiza simultáneamente el empalme de numerosos genes, con un enfoque global, aplicable a todos los pacientes. Este enfoque evita el diseño personalizado de cebadores, que pueden verse sesgados por la interpretación de las predicciones de empalme, mientras que RNA-Seq captura y secuencia sistemáticamente todas las transcripciones. Finalmente, RNA-Seq proporciona información adicional en comparación con la secuenciación de ADN, como la detección de omisión de exones, inclusión de intrones y la creación de transcripciones de fusión.

En el proyecto GTEx (GTEx Consortium, 2013), los niveles de expresión de las transcripciones del genoma humano se cuantificaron mediante RNA-Seq. Utilizando estos resultados, los investigadores del estudio midieron la expresión de transcripciones de genes conocidos de ELA en sangre total. Aplicando un valor umbral de 0,5 transcripciones por millón de lecturas (TPM), 25 de los 30 genes de ELA analizados actualmente por NGS en diagnósticos de rutina en el Hospital Universitario de Nîmes podrían ser elegibles para un análisis completo mediante RNA-Seq. Ninguno de los laboratorios franceses que realizan análisis genéticos de la ELA ha desarrollado todavía RNA-Seq como herramienta de diagnóstico de rutina. El laboratorio del estudio recibe más de 600 solicitudes de diagnóstico genético de pacientes de ELA al año. Por tanto, el objetivo de este estudio es desarrollar un método global para analizar transcripciones de ARN de genes de ELA para categorizar las mutaciones y mejorar el tratamiento diagnóstico de los pacientes.